Особенности мукозального иммунитета и состояния бактериоценоза при различных формах аллергического ринита

Полный текст

Распространённость аллергического ринита в различных регионах Российской Федерации у населения, по данным Н.И. Ильиной, составляет от 10 до 20% общей популяции[1]. Показано, что при развитии хронического воспалительного процесса на слизистой оболочке носа, в основе которого лежат опосредованные иммуноглобулином Е иммунные реакции немедленного типа, возникают выраженные изменения в составе назального бактериоценоза с доминированием таких видов, как Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis [5, 6]. В свете современных представлений формирующиеся нарушения бактериоценоза при развитии аллергического воспаления можно объяснить существенными изменениями в функционировании местной врождённой иммунной системы, которые приводят к снижению колонизационной резистентности и бесконтрольному размножению условно-патогенных видов бактерий, не свойственных нормоценозу [2, 3]. Один из возможных вариантов - срыв в системе врождённого распознавания патогенов, с которыми перманентно сталкивается слизистая оболочка респираторного тракта, а также нарушение механического барьера слизистой оболочки при воспалении. Открытие ХХI века в иммунологии Ж. Хоффмана, Б. Бойтлера [12], перечеркнувшее все старые представления о «неспецифичности» врождённого иммунитета, установило, что благодаря сравнительно недавно открытым однотипным рецепторам, получившим название толл-подобных (Toll-подобных), врождённая иммунная система обеспечивает регуляцию адаптивного иммунного ответа организма на чужеродные антигены (аллергены), как правило, микробного происхождения. Исследования, направленные на установление врождённых компонентов местного иммунитета слизистых оболочек верхних дыхательных путей при аллергическом рините, раскрывающие особенности экспрессии рецепторов толл-подобной группы на эпителиоцитах слизистой оболочки носа и взаимосвязь с важными секреторными компонентами назального секрета, характеризующие активацию адаптивного иммунитета у этой группы пациентов, сегодня немногочисленны, но представляют существенную актуальность для разработки патогенетически обоснованных способов терапии этих пациентов [10, 14]. Цель настоящего исследования - определение некоторых показателей местного иммунного статуса [доля эпителиоцитов, экспрессирующих толл-подобные рецепторы 2-го типа (TLR-2), и содержание интерлейкина-10 (ИЛ-10) в назальных секретах] у пациентов с различными формами аллергического ринита, протекающего на фоне бактериальной колонизации слизистой оболочки носа. Изучен биологический материал (назальные смывы, образцы эпителия), полученный от 25 пациентов с сезонным аллергическим ринитом (n=10) в возрасте от 12 до 32 лет (20,0±2,4 года) и круглогодичным аллергическим ринитом (n=15) в возрасте от 18 до 45 лет (27,9±2,8 года), а также от группы сравнения, репрезентативной по полу и возрасту, состоящей из 20 человек в возрасте 18- 45 лет (в среднем 26,4±2,9 года) без аллергической патологии. Состояние бактериоценоза пациентов оценивали унифицированным бактериологическим методом. Смывы из полости носа получали в положении больного сидя с отклонённой назад головой путём введения с помощью одноразового шприца (зонда) тёплого стерильного изотонического раствора натрия хлорида в объёме от 3 до 5 мл. Образцы со слизистой оболочки носа забирали сухим стерильным ватным тампоном на пластиковой основе. Тампон вводили по наружной стенке носового хода на глубину 2-2,5 см до нижней носовой раковины. После взятия материала тампон помещали в стерильную пробирку, содержащую транспортную среду (среда 199), которую использовали для получения клеточных суспензий. После фильтрации через нейлоновый фильтр из суспензии клеток готовили мазки, которые окрашивали 0,04% раствором трипанового синего и микроскопировали (увеличение ×80) с подсчётом общего количества неокрашенных эпителиальных клеток в гемоцитометре Горяева в 100 больших квадратах, рассчитывая количество клеток в 1 мл пробы образца. Долю эпителиальных клеток, экспрессирующих TLR-2, определяли методом проточной цитометрии на анализаторе «FACSCanto II» в клеточной суспензии, разделённой на равные объёмы, в которые вносили моноклональные антитела с флюоресцентными метками [«antihuman TLR-2 alexa fluor 488 conj», «Invitrogen», антитела к цитокератину 19 (RCK108) «PE conj», S.C. Biotechnology]. Концентрацию ИЛ-10 в смывах определяли твердофазным иммуноферментным методом с помощью тест системы «ИЛ-10-ИФА-Бест» («ВекторБест», Россия), согласно инструкции производителя. Расчёт концентрации ИЛ-10 проводили по отношению к содержанию белка в образце назальных смывов и выражали в пикограммах на 1 мг белка (пг/мг белка). Концентрацию белка в образцах назальных смывов определяли по методу Бредфорд [8]. Состояние бактериоценоза при аллергическом рините и уровень эпителиоцитов слизистой оболочки носа, экспрессирующих TLR-2. В группе пациентов с сезонным аллергическим ринитом установлена сенсибилизация к пыльцевым аллергенам в 100% случаев, в группе пациентов с круглогодичным аллергическим ринитом выявлена сенсибилизация к бытовым (7 случаев, 46,7%) и эпидермальным (8 случаев, 53,3%) аллергенам. У пациентов с круглогодичным аллергическим ринитом из данной выборки в составе бактериоценоза постоянно высевался S. aureus (100%) в различных ассоциациях со Str. pyogenes (33,3%), Neisseria spp. (66,7%). У пациентов с сезонным аллергическим ринитом нарушения бактериоценоза, характеризовались ассоциациями S. aureus cо S. hemolyticus (70,0%). В группе сравнения в состав бактериоценоза слизистой оболочки носа входили такие виды, как S. epidermidis (50,0%) в ассоциациях со Str. viridians (25,0%) или S. hominis (25,0%). Учитывая наличие грамположительной микрофлоры в составе бактериоценоза носа как у пациентов с аллергическим ринитом, так и в группе сравнения без аллергической патологии, нами проведена оценка доли эпителиоцитов, экспрессирующих TLR-2, ответственных за распознавание пептидогликанов и липотейхоевых кислот клеточной стенки грамположительных бактерий и активацию эпителиальных клеток с образованием ряда хемокинов. Было установлено (табл. 1), что в группе пациентов с сезонным аллергическим ринитом доля эпителиоцитов, экспрессирующих TLR-2, в 1,9 раза ниже, чем в группе сравнения , а при круглогодичном аллергическом рините - в 1,7 раза ниже. В группе здоровых минимальная доля позитивных эпителиоцитов составила 11,0%, а в группе Таблица 1 Эпителиальные клетки, позитивные по толлподобным рецепторам 2-го типа (TLR-2), в назальных смывах обследуемых Группы TLR-2-позитивные эпителиоциты, M±m (Qmin-Qmaх), % 1Сезонный аллергический ринит (n=10) 17,7±3,0 (5,0-34,0)* 2Круглогодичный аллергический ринит (n=15) 19,3±3,6 (3,0-34,0)** Условно здоровые (n=20) 33,0±3,2 (11,0-56,0) Примечание: *значения в выборке пациентов с сезонным аллергическим ринитом достоверно отличаются по U-критерию Манна-Уитни от группы сравнения, U(38,0) <U(51,0); **значения в выборке эмп кр 0,05 пациентов с круглогодичным аллергическим ринитом достоверно не отличаются по U-критерию Манна-Уитни, U(112,5) >U(105,0); 1-2различия между груп эмп кр 0,05 пами пациентов с сезонным аллергическим ринитом и круглогодичным аллергическим ринитом достоверно не различаются по U-критерию Манна-Уитни, U(57) >U(44,0). эмп кр 0,05 пациентов с аллергическим ринитом: 5,0% - при сезонном аллергическом рините, 3,0% - при круглогодичном аллергическом рините. Установлена прямая сильная зависимость между показателем микробного обсеменения (ПМО) слизистой оболочки носа стафилококками и долей эпителиоцитов, экспрессирующих TLR-2, как при патологии (аллергический ринит), так и у здоровых добровольцев (рис. 1). При аллергическом рините у пациентов в зависимости от доли эпителиоцитов, экспрессирующих TLR-2, были установлены следующие особенности микробного обсеменения слизистой оболочки носа. У 24,0% пациентов с аллергическим ринитом (6 из 25) с уровнем эпителиоцитов Рис. 1. Корреляция между показателем микробного обсеменения (ПМО) слизистой оболочки носа стафилококковой микрофлорой (S. aureus + S. epidermidis) в исследуемых группах и долей (%) эпителиоцитов, позитивных по толл-подобным рецепторам 2-го типа (TLR-2), в смывах со слизистой оболочки носа: А - в группе пациентов с сезонным аллергическим ринитом; Б - в группе пациентов с круглогодичным аллергическим ринитом; В - в группе сравнения. не более 11,0% ПМО для S. aureus не превышал 103 КОЕ/тампон, у 20,0% (5 из 25) при доле эпителиоцитов более 34,0% ПМО для стафилококковой микрофлоры (S. aureus, S. hemolyticus) был выше 104 КОЕ (105-106). У здоровых пациентов в 5,0% (1 из 20) случаев ПМО для стафилококковой микрофлоры (S. epidermidis) при доле эпителиоцитов до 11,0% составил 103 КОЕ, в 12,0-33,0% - 104 КОЕ, свыше 34,0% - 105 КОЕ (S. epidermidis или S. hominis в ассоциациях). Уровень цитокина ИЛ-10 в назальных смывах и содержание TLR-2-позитивных эпителиоцитов при аллергическом рините. Цитокин ИЛ-10 обладает иммуносупрессивной активностью, а также играет ключевую роль при аллергическом воспалении. Нами установлена обратная корреляционная зависимость между долей эпителиоцитов, экспрессирующих TLR-2, и содержанием ИЛ-10 в назальных смывах здоровых добровольцев (r=-0,49, p <0,05). У пациентов с аллергическим ринитом установлена прямая сильная корреляция между долей TLR-2-позитивных эпителиоцитов и содержанием ИЛ-10 в назальных смывах (рис. 2). Относительное содержание ИЛ-10 в смывах у Рис. 2. Корреляция между содержанием интерлейкина-10 (ИЛ-10) в назальных смывах и долей (%) эпителиоцитов, экспрессирующих толл-подобные рецепторы 2-го типа (TLR-2), у пациентов с аллергическим ринитом и здоровых добровольцев: А - группа пациентов с сезонным аллергическим ринитом; Б - группа пациентов с круглогодичным ринитом; В - группа сравнения (условно здоровые). пациентов с аллергическим ринитом составило 4,1±0,3 пг/мг белка, в группе здоровых добровольцев - 3,2±0,3 пг/мг белка, различия между группами не имеют статистической значимости. В нашем исследовании установлено, что при аллергическом воспалении слизистой оболочки носа и нарушении в составе назального бактериоценоза, сопровождающемся выраженной персистенцией видов, относящихся к грамположительной стафилококковой микрофлоре, с постоянным присутствием S. aureus, у пациентов с аллергическим ринитом происходит увеличение экспрессии TLR-2 на эпителиоцитах, как в группе пациентов с круглогодичным аллергическим ринитом (r=0,86, p <0,05), так и при сезонном аллергическом рините (r=0,69, p <0,05). Статистически значимое снижение доли TLR-2-позитивных эпителиоцитов (в 1,9 раза) установлено только при сезонном аллергическом рините (исследование проведено в период сезонного обострения заболевания с выраженной симптоматикой) по сравнению со здоровыми добровольцами. Учитывая существенную роль TLR-2 в реализации врождённого иммунного ответа, можно предположить, что снижение экспрессии и соответственно количества эпителиоцитов, несущих эти рецепторы на слизистой оболочке носа при сезонном аллергическом рините, определяет высокий риск формирования инфекционно-воспалительных заболеваний носа, обусловленных грамположительной микрофлорой, по сравнению с пациентами с круглогодичной формой ринита (у которых достоверного различия в уровне эпителиоцитов, экспрессирующих эти рецепторы, не установлено). Таким образом, увеличение ПМО грамположительной микрофлорой слизистой оболочки носа и изменения в назальном бактериоценозе при аллергическом рините приводят к увеличению содержания эпителиоцитов, экспрессирующих TLR-2, то есть происходит активация их экспрессии, что согласуется с исследованиями, показавшими, что увеличение экспрессии этих рецепторов тесно коррелирует с развитием инфекции в конкретном биотопе [4, 13]. При активации компонентами микрофлоры рецепторов врождённого иммунитета, в частности толл-подобных, экспрессируемых на эпителии слизистых оболочек, происходит последовательная активация дополнительных молекул, таких как адаптерные белки (MyD88), протеинкиназы, транскрипционные факторы (например, NF-kB), результатом чего становятся изменение экспрессии генов провоспалительных цитокинов и активация синтеза противовоспалительного ИЛ-10 [11]. Можно предположить, что при аллергическом воспалении у пациентов с ринитом при выраженном нарушении в составе бактериоценоза происходит активация экспрессии ТLR-2, в том числе и на эпителиоцитах слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Это способствует синтезу как провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, фактора некроза опухоли альфа), так и ИЛ-10, обладающего противовоспалительными эффектами, но в тоже время повышающего активность лимфоцитов Th-2 [7, 9] ВЫВОДЫ Уровень эпителиоцитов, экспрессирующих толл-подобные рецепторы 2-го типа, статистически значимо снижен (в 1,9 раза) только при сезонном аллергическом рините по сравнению с аналогичным показателем у здоровых добровольцев. Увеличение показателя микробного обсеменения слизистой оболочки носа стафилококками при аллергическом рините приводит к увеличению содержания эпителиоцитов, экспрессирующих толл-подобные рецепторы 2-го типа, в назальных смывах.

Об авторах

Юрий Александрович Тюрин

Казанский государственный медицинский университет

Email: immunolab@yandex.ru

Елена Исаевна Шапкина

Казанский государственный медицинский университет

Ильшат Ганиевич Мустафин

Казанский государственный медицинский университет

Рустэм Салахович Фассахов

Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии; Казанская государственная медицинская академия

Список литературы

Дополнительные файлы