Novel perspective substances with selective anti-aggregant action

Full Text

Одним из выдающихся достижений научно-исследовательской лаборатории профессора Д.М. Зубаирова было создание функциональной концепции инициирования системы гемостаза. Её суть заключается в том, что поверхность клеток, контактирующих с кровью, атромбогенна, но при воздействии различных физиологических и патологических агентов она приобретает способность связывать и активировать факторы свёртывания. Эти индукторы, воздействуя на специфические клеточные рецепторы или просто повреждая клетки, приводят к трансформации поверхности мембраны и приобретению ею тромбогенных свойств. В ходе многолетних исследований молекулярных механизмов взаимодействия факторов свёртывания с клеточными мембранами было установлено, что необходимым элементом связывания факторов свёртывания и их активации является экспонирование фосфатидилсерина и появление мезоморфных структур в мембранах [4, 5]. Использование полученных представлений позволило провести целенаправленный синтез соединений, обладающих способностью воздействовать на эти процессы. В качестве исходного вещества был использован β-пинен, относящийся к природным монотерпенам. Терпены представляют собой обширный класс природных веществ, содержащихся во всех живых организмах. Одна из функций терпеновых соединений - придание механических свойств клеточным мембранам. Их молекулы жёсткие, амфифильные и обеспечивают ван-дерваальсовы взаимодействия с фосфолипидами клеточных мембран. Кроме того, они участвуют и в ключевых процессах, протекающих в мембранах: фарнезол - в алкилирование протеинов на стадии их созревания, убихиноны - в электронных переносах, доликолы участвуют в образовании протеиновых гликозидов. Всё это играет важную роль в формировании и стабилизации мембран [9]. Известно, что сера относится к биогенным элементам, а сульфиды, сульфоксиды и сульфоны природных углеводородов зачастую обладают фармакологической активностью, поэтому объединение в одной молекуле двух фармакофорных фрагментов - терпенового скелета и серосодержащей функции - является предпосылкой для получения новых биологически активных соединений с низкой токсичностью [7]. Сульфиды получали реакцией электрофильного присоединения тиолов по двойной связи β-пинена в присутствии хлористого цинка [6]. Реакции протекали c сохранением пинановой структуры молекулы и образованием аддуктов против правила Марковникова. При окислении полученных сульфидов до сульфоксидов такими окислителями, как периодат натрия, мета-хлорнадбензойная кислота, диоксид селена с перекисью водорода и сульфурил хлорид в комбинации с этиловым спиртом, было установлено, что наилучший результат достигается при использовании метода асимметрического окисления с применением окислительной системы Ti(Oi-Pr)4/(R)-миндальная кислота/t-BuOOH [2, 3]. Структуру полученных соединений устанавливали при помощи ядерно-магнитного резонанса 1Н и 13С («Bruker Avance», Германия), хроматомасс-спектрометрии («Turbo Mass Gold», «Perkin Elmer») и рентгеноструктурного анализа («Smart Apex II automatic diffractometer»). Возможность использования полученных веществ для коррекции гемостаза определяли in vitro на плазме крови человека. Венозную кровь получали путём пункции кубитальной вены и стабилизировали 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 9:1. Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали в течение 10 мин при 1000 оборотах в минуту. Верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток повторно центрифугировали в течение 20 мин при 3000 оборотах в минуту для получения плазмы, бедной тромбоцитами, которую использовали для разведения богатой тромбоцитами плазмы до фиксированной объёмной концентрации тромбоцитов и определения коагуляционного гемостаза. Для оценки системы гемостаза применяли определение скорости агрегации тромбоцитов и поверхностно-зависимые стандартные коагуляционные тесты: активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое и тромбиновое время с расчётом международного нормализованного отношения. Агрегационную активность тромбоцитов устанавливали с помощью анализатора «Chrono-Log Corporation» (США) по методу G. Born [8]. Оптическим контролем служил такой же объём плазмы, не содержащей тромбоциты. О степени агрегации судили по максимальной величине падения оптической плотности после окончания реакции по сравнению с исходной величиной. Коагуляционную активность определяли на коагулометре «Минилаб-7001» (Россия). Для определения спонтанной агрегации тромбоцитов и коагуляционной активности плазмы использовали венозную кровь пациентов с ишемической болезнью сердца и выраженными изменениями в системе гемостаза, а индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали на плазме, полученной от здоровых доноров. С этой целью к 0,45 мл плазмы добавляли 0,05 мл раствора, содержащего 17 мМ препарата в растворе этилового спирта, и инкубировали полученную смесь в течение 5 мин при температуре 37 °C. В контрольных опытах к плазме добавляли растворитель, используемый для приготовления препарата (8-32,45% водного раствора этилового спирта). Для индукции агрегации тромбоцитов применяли растворы аденозиндифосфата (АДФ, 5 мкМ), эпинефрина (адреналина, 10 мкМ), коллагена (2 мкг/мл), арахидоновой кислоты (0,5 мМ) и ристомицина (1 мг/мл). Относительную эффективность полученного соединения определяли путём сравнения с ацетилсалициловой кислотой и клопидогрелом (плавиксом) как широко применяемыми в клинике Наиболее растворимый в воде пинанилсульантиагрегационными препаратами. Для этого фоксид (V) показал высокую антиагрегацииспользовали плазму пациентов, страдающих онную активность - практически полностью ишемической болезнью сердца, которые получа-ингибировал агрегацию тромбоцитов человека, ли соответствующие лекарственные препараты. индуцированную арахидоновой кислотой и кол Результаты исследования обработаны с помо-лагеном, а также снижал АДФ- и, в большей щью пакета статистических программ Microsoft степени, адреналин-индуцированную агрегацию Excel. Достоверность различий параметров опре-(табл. 2). деляли с применением регрессионного и вари-Сравнение с ацетилсалициловой кислотой и ационного анализа, критерия Стьюдента при клопидогрелом показало, что при АДФ- и адреуровне значимости р <0,05. налин-индуцированной агрегации пинанилсуль Таблица 1 Влияние производных тиотерпеноидов пинанового ряда на агрегацию тромбоцитов и показатели коагуляционного гемостаза in vitro у пациентов с ишемической болезнью сердца Соединение в растворе С2H5OH Скорость агрегации, отн.ед/мин Показатель агрегации, отн.ед АЧТВ, с Протромбиновое время, с МНО Тромбиновое время, с Без препарата (I) в 0,265±0,185 2,01±0,6 26,5±4,21 15,0±3,6 1,54±0,2 15,5±0,3 29,8% спирта, n=14 0,012±0,02* 1,37±0,02* 30,1±5,1* 19,2±3,4* 1,82±0,3* 15,3±0,4 Без препарата (II) в 0,94±0,54 3,46±0,94 25,96±2,9 16,1±1,5 1,52±0,33 14,7±0,4 32,6% спирта, n=14 0,073±0,02* 2,21±0,24* 28,34±3,6* 17,8±2,1* 1,71±0,32* 14,9±0,2 Без препарата (III) в 0,723±0,495 3,21±0,97 27,5±5,12 17,0±2,5 1,74±0,41 15,6±0,2 21,5% спирта, n=10 0,031±0,02* 1,25±0,37* 29,2±5,72* 18,19±2,4* 1,91±0,29* 15,9±0,3 Без препарата (IV) в 0,295±0,08 2,28±0,29 24,96±3,1 17,22±1,11 1,42±0,43 16,1±0,3 28,1% спирта, n=8 0,16±0,032* 1,73±0,25* 26,34±4,2* 18,5±2,21* 1,54±0,42* 16,2±0,1 Без препарата (V) в 0,718±0,58 3,32±0,87 25,83±2,21 19,02±1,1 1,22± 0,14 15,1±0,9 8,0% спирта, n=19 0,04±0,01* 1,29±0,24* 30,6± 1,51* 24,8±1,81* 1,54± 0,11* 15,3±0,6 Примечание: I - пинанилсульфид с фрагментом меркаптоэтанола; II - пинанилсульфид с метилмеркаптоацетатным фрагментом; III - пинанилсульфоксид с фрагментом меркаптоэтанола; IV - пинанилсульфоксид с метилмеркаптоацетатным фрагментом; V - пинанилсульфоксид с фрагментом меркаптоуксусной кислоты; n - количество измерений; *p <0,05 по сравнению с показателями без препарата; отн.ед - относительные единицы; АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время, МНО - международное нормализованное отношение. Полученные результаты показали, что исходное вещество β-пинен не влияет на состояние системы гемостаза пациентов с ишемической болезнью сердца, а у синтезированных на его основе соединений была обнаружена высокая антиагрегационная активность: спонтанная скорость и показатель агрегации значительно уменьшались и в некоторых случаях достигали нормальных значений (не более 0,05 и 1,35 относительных единиц в минуту соответственно, табл. 1). Кроме того, они также снижали и коагуляционную активность плазмы: нормализовалось активированное частичное тромбопластиновое время, увеличивались протромбиновое время и международное нормализованное отношение. Однако при этом наши соединения не влияли на активность тромбина (тромбиновое время не изменялось). Это означает, что полученные вещества ингибируют активацию коагуляционных факторов и не изменяют их ферментативную активность. фоксид обладает таким же антиагрегационным эффектом, как ацетилсалициловая кислота, но уступает в 1,4 раза клопидогрелу при агрегации, вызванной АДФ (табл. 2). В случае коллагеновой и арахидоновой активации тромбоцитов эффективность пинанилсульфоксида оказалась более значимой как в сравнении с ацетилсалициловой кислотой (в 3,9 и 10 раз соответственно), так и с клопидогрелом (в 3,4 и 10 раз). Таким образом, отличительная особенность нашего соединения - его способность избирательно блокировать агрегацию тромбоцитов, вызываемую коллагеном и арахидоновой кислотой. Коллаген-индуцированная активация тромбоцитов осуществляется в основном через их Р2Х1-рецепторы [12]. В настоящее время считают, что роль Р2Х1-рецепторов не столь значима для полноценной активации тромбоцитов, так как при фармакологической блокаде Р2Y1-и Р2Y12рецепторов стимуляция Р2Х1-рецепторов приво Таблица 2 Влияние соединений на индуцированную in vitro агрегацию тромбоцитов (%) Индуктор Контроль, n=19 Пинанилсульфоксид (V), n=19 АСК, n=12 Клопидогрел, n=11 Аденозиндифосфат, норма 50-75 54,41±1,56 49,33±1,31*# 46,3±9,1# 35,1±3,2#† Адреналин, норма 60-71 66,5±2,50 40,33±7,31*# 36,3±3,1# 51,3±0,7† Арахидоновая кислота, норма 62-69 65,5±3,50 1,2±0,9*# 24,6±2,4#† 64,6±2,8† Коллаген, норма 50-75 63,33±10,21 9,8±4,1*# 38,4±14,6#† 33,1±10,7#† Ристомицин, норма 50-75 66,66± 6,31 70,66±1,32 48,2±19,1† 56,4±9,8† Примечание: АСК - ацетилсалициловая кислота; *p <0,05 по отношению к контролю, #p <0,05 по отношению к норме, †p <0,05 по отношению к соединению пинанилсульфоксид (V). дит лишь к изменению формы тромбоцитов [14]. Кроме того, генетически дефицитные по Р2Х1рецепторам мыши не имеют видимых проблем с точки зрения физиологического гемостаза и устойчивы к системному тромбозу, вызываемому смесью коллагена и адреналина [10]. Однако мыши с генетически увеличенным содержанием Р2Х1-рецепторов по сравнению с обычными особями более склонны к системному тромбозу [13], что и подтверждают эксперименты с селективным антагонистом Р2Х1-рецепторов NF449, который угнетает активацию тромбоцитов и замедляет тромбообразование in vivo [11]. Всё это свидетельствует о том, что потенциальные блокаторы Р2Х1-рецепторов могут иметь клиническое значение. В свете этого полученные сульфиды и сульфоксиды пинанового ряда являются перспективными соединениями, которые наряду с ацетилсалициловой кислотой и клопидогрелом могли бы быть использованы в качестве антиагрегантов для профилактики инсульта и инфаркта миокарда. Кроме того, всесторонние экотоксикологические исследования монотерпенов, включающие испытания на острую токсичность для человека, животных и растений, а также тесты на генотоксичность, тератогенную токсичность и влияние на репродуктивную функцию организмов показали, что терпены относятся к малотоксичным соединениям, не обладают мутагенными свойствами и не являются репродуктивными ядами [1]. Следовательно, учитывая способность наших веществ полностью подавлять спонтанную активацию тромбоцитов и низкую токсичность серосодержащих терпенов (полулетальная доза 4900±4100 мг/кг), полученные вещества можно применять при трансфузиологии в качестве стабилизаторов препаратов крови. ВЫВОДЫ 1. Полученные сульфиды и сульфоксиды пинанового ряда нормализуют in vitro спонтанную агрегацию тромбоцитов в плазме крови пациентов с ишемической болезнью сердца и снижают её коагуляционную активность, что позволяет рассматривать их как потенциальные лекарственные средства для профилактики тромбофилии. Снижение агрегационной активности тромбоцитов обусловлено в основном способностью полученных веществ избирательно блокировать Р2Х1-рецепторы тромбоцитов. Свойство синтезированных серосодержащих терпенов подавлять спонтанную активацию тромбоцитов в сочетании с низкой токсичностью позволяет рассматривать их как перспективные вещества для применения в трансфузиологии в качестве стабилизаторов препаратов крови.

About the authors

S V Kiselev

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

L E Nikitina

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Email: nikitl@mail.ru

M M Vorontsova

Republican Station of blood transfusion, Kazan, Russia

R G Turaev

Republican Station of blood transfusion, Kazan, Russia

References

Supplementary files