Biochemical markers of industrial pollutants action on the rubber industry workers

Full Text

В современных условиях особую актуальность цитов. Осмотическую резистентность эритроцитов приобретает регистрация ранних проявлений па-изучали по методу Waugh и Asherman (1938) в модитогенного воздействия химических загрязнителей фикации Н.Л. Василевской (1955) и Cohen (1958), а на метаболизм и функционирование отдельных кислотную резистентность эритроцитов - методом, органов и систем. Одним из чувствительных по-предложенным И.И. Гительзоном и И.А. Терскоказателей реагирования клеток на химические вым (1959). Гемолизат использовали в качестве воздействия, по мнению ряда авторов, является со-источника ферментов - каталазы, пероксидазы, стояние свободнорадикального и микросомального супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, окисления [1]. глутатионредуктазы, глутатион-S-трансферазы, Базой исследования были выбраны гексокиназы, фосфофруктокиназы, пируваткиОАО «Уфимский завод эластомерных материалов назы, глицероальдегидфосфатдегидрогеназы, и конструкций» (115 участников исследования) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, Na+,K+-и Ca+2,Mg+2ЗАО «Каучук» (110 участников) - ведущие произ-зависимых АТФаз; плазму - для определения соводства нефтехимической промышленности Ре-держания витаминов Е и С, уровня сульфгидрильспублики Башкортостан. С письменного согласия ных (SH) и дисульфидных (SS) групп, количества пациентов в одно и то же время (приблизительно восстановленного глутатиона. В эритроцитах и в 10 ч утра) натощак осуществляли забор крови из плазме крови изучали содержание ионов K+, Na+ , вены, слюны и мочи в количестве 10 мл. Са2+, Mg2+ и неорганического фосфата (Рн). Кровь, стабилизированную гепарином, для вы-Слюну собирали путём сплёвывания в чистый деления эритроцитов центрифугировали в течение стакан в течение 10 мин после предварительного 10 мин («К-24 D», Германия) при 3000 оборотов в полоскания полости рта тёплой кипячёной водой. минуту и температуре +2 °C. Осадок эритроцитов Для удаления клеток слюну центрифугировали. 3 раза отмывали холодным изотоническим раство-Об интенсивности процессов свободнорадикальром натрия хлорида. Отмытые эритроциты гемо-ного окисления судили по содержанию продуклизировали в 5,0 мМ ТРИС-НСl буфере с рН=7,6 в тов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой соотношении 1:9 в течение 30 мин при температуре (ТБК-активных продуктов), с помощью цветной +4 °C. реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в присут Часть крови использовали для определения ствии трихлоруксусной кислоты и по показателям кислотной и осмотической резистентности эритро-хемилюминесценции. Максимум поглощения окрашенного комплекса ТБК-активных продуктов приходится на 532 нм (молярный коэффициент 1,56×10-5 м-1·см-1). Для определения хемилюминесценции плазмы крови и ротовой жидкости 0,5 мл пробы разводили в 18,5 мл солевого раствора следующего состава: 20 мМ KН2РО4, 105 мМ KСl, рН=7,45. Интенсивность хемилюминесценции регистрировали на хемилюминометре-3. Ферментативное звено антиоксидантной защиты изучали путём определения активности каталазы [4], пероксидазы [2], супероксиддисмутазы [7], глутатионпероксидазы [12], глутатионредуктазы [8] и глутатионS-трансферазы [10], а неферментативное - по содержанию восстановленного глутатиона [5], SS-и SH-групп [6], α-токоферола [11] и аскорбиновой кислоты с помощью стандартного тест-набор фирмы «Boehringer Mannheim». Содержание аденозинтрифосфата (АТФ), аденозиндифосфата (АДФ) и аденозинмонофосфата (АМФ) в эритроцитах определяли с помощью стандартных наборов «Test combination ATP» и «Test combination ADP/AMP» фирмы «Boehringer Mannheim». Для оценки соотношений активности энергосинтезирующих и энергоутилизирующих систем клеток использовали показатель энергетического заряда эритроцитов (ЭЗЭ) [3]: ЭЗЭ = 2 × (АТФ + АДФ) / (АТФ + АДФ + АМФ) × 2. Рассчитывали соотношение АТФ/АДФ. Определяли фосфатный потенциал по формуле: АДФ × АМФ / АТФ. Соотношение прямых и обратных процессов преобразования АДФ в аденилаткиназной реакции рассчитывали по коэффициенту К: К = АТФ × АМФ / АДФ2. Активность ферментов энергетического метаболизма изучали с применением методов, описанных в литературе: гексокиназа, пируваткиназа, фосфофруктокиназа и глицероальдегидфосфатдегидрогеназа - [2], глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа - [9], Na+,K+-и Ca+2,Mg+2-зависимые АТФазы - [13]. Перенос ионов через мембраны оценивали по изменению их содержания в среде потенциометрическим методом с помощью селективных стеклянных электродов. Состав среды: 100 мМ трис-фосфатный буфер, содержащий 0,4 мМ MgSO4, 1 мM NaCl и различные концентрации KCl; рН среды регулировали с помощью трис-буфера или НCl. Состояние цитохром Р450-зависимой монооксидазной системы оценивали по скорости деметилирования вводимого в организм лекарственного препарата (антипирина), ацетилирование - по скорости выведения изониазида и его ацетилированных производных [2]. Учитывая специфику производственных факторов, особенность их действия на организм работающих, пути поступления токсичных веществ (через органы дыхания, ротовую полость, кожу рук), были сформированы две группы (группа А и группа Б), в каждой из которых выделено две подгруппы. В группу А вошли работники, имеющие комбинированный контакт с ароматическими углеводородами (бензол, 1,2,4-триметилбензол, 1,2,4,5-тетраметилбензол, толуол): подгруппа 1А - рабочие (62 человека с повышенным риском развития профессионального заболевания), имеющие постоянный контакт с производственными загрязнителями в течение 5 лет; подгруппа 2А - рабочие (48 человек с подозрением на хроническую профессиональную интоксикацию), имеющие постоянный контакт с производственными загрязнителями в течение 10 лет и более (ЗАО «Каучук»). В группу Б вошли работники, имеющие комбинированный контакт с хлорированными углеводородами (1,2-дихлорэтан, хлористый метилен, трихлорэтилен, тетрахлорметан): подгруппа 1Б - рабочие (63 человека, группа риска), имеющие постоянный контакт с производственными загрязнителями в течение 5 лет; подгруппа 2Б - рабочие (52 человека с подозрением на хроническую профессиональную интоксикацию), имеющие постоянный контакт с производственными загрязнителями в течение 10 лет и более (ОАО «Уфимский завод эластомерных материалов и конструкций»). Контрольную группу составили 40 работников административно-управленческого аппарата, трудовой процесс которых исключает воздействие факторов производственной среды. Статистическую обработку результатов исследований проводили с вычислением параметров вариационной статистики с примене Рис. 1. Содержание ТБК-активных продуктов (реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой) в плазме крови, эритроцитах и смешанной слюне у обследованных, имеющих производственный контакт с хлорированными углеводородами (% по отношению к контролю). нием компьютерного пакета программы «Statistica for Windows» (версия 5.0). У людей, подвергшихся в процессе профессиональной деятельности действию неблагоприятных факторов производственной среды, в плазме крови, эритроцитах, смешанной слюне и моче обнаружены существенные сдвиги в изучаемых показателях. Так, в плазме крови, эритроцитах и ротовой жидкости у обследованных подгрупп 1А и 1Б, особенно в подгруппах 2А и 2Б, выявлено повышение уровня ТБК-активных продуктов (рис. 1). в подгруппах 1А и 1Б хемилюминесценция мочи либо оставалась прежней, либо изменялась в сторону увеличения. Система антиоксидантного статуса представлена различными соединениями: первая линия включает ферменты каталазу и супероксиддисмутазу, вторая и третья линии - соответственно ферменты глутатионпероксидазу, глутатионредуктазу, глутатион-S-трансферазу и неферментные антиоксиданты (α-токоферол, аскорбиновую кислоту, SH-группы, глутатион и др.). ных, подвергнутых действию хлорированных углеводородов (% по отношению к контролю); Cn - спонтанное свечение; S - усиление интенсивности излучения светосуммы; А - амплитуда быстрой вспышки; π - латентный период; tg <α - увеличение уровня максимальной амплитуды медленной вспышки; Мах - максимальная амплитуда отклонения. На интенсивность процессов свободнорадикального окисления у рабочих, подвергнутых действию химических загрязнителей, указывают и результаты изучения хемилюминесценции плазмы крови, смешанной слюны и мочи (рис. 2). Спонтанное свечение, определяющее скорость свободнорадикального окисления без внешнего вмешательства, в плазме крови и слюне в подгруппах 1А и 1Б повышалось в 1,5-1,7 раза и соответственно в 2,4-3,3 раза в подгруппах 2А и 2Б. Усиление интенсивности излучения светосуммы, характеризующее способность биологического материала подвергаться окислению, наблюдаемое в подгруппах 1А и 1Б, резко увеличивалось в подгруппах 2А и 2Б. Амплитуда быстрой вспышки, возникающая в момент добавления инициатора окисления, в подгруппах 1А и 1Б возрастала в 1,2-1,5 раза по сравнению с контрольной группой, а в 2А и 2Б - соответственно в 1,9-2,8 раза. В обеих основных профессиональных группах (А и Б) отмечено увеличение уровня максимальной амплитуды медленной вспышки (tg <α), характеризующее инициирование свободнорадикального окисления. Латентный период (π), определяющий антиокислительные резервы биологического материала, существенно превышал исходное значение в подгруппах 1А и 1Б, а у работников из подгрупп 2А и 2Б, напротив, зарегистрировано падение уровня антиокислительных свойств плазмы крови и слюны. В то же время хемилюминесценция мочи у обследованных из подгрупп 2А и 2Б существенно отличалась от контрольной группы, а Результаты исследования антиоксидантной системы в эритроцитах и смешанной слюне у обследованных показывают, что на фоне усиления процессов свободнорадикального окисления и липопероксидации в подгруппах 1А и 1Б обнаруживается активация ферментов антиоксидантной защиты, а в подгруппах 2А и 2Б - разнонаправленность их изменений. Так, активность ферментов антиоксидантной защиты в эритроцитах и слюне у лиц подгрупп 1А и 1Б существенно возрастала, в подгруппах 2А и 2Б, напротив, снижалась (рис. 3). Одновременно в плазме крови у обследованных обеих групп изменялись уровень SH-, SS-групп и соотношение SH/SS. Основным низкомолекулярным SH-соединением в организме является глутатион, на долю которого приходится до 90% всех тиоловых соединений. Его содержание в плазме крови у обследованных в тех же группах уменьшалось (рис. 4). Колебание уровня α-токоферола и витамина С в плазме крови и слюнной жидкости у работников, контактирующих с химическими загрязнителями, не было статистически значимым (табл. 1). В эритроцитах выявлено уменьшение содержания катионов K+, Mg2+, Са2+ и повышение концентрации ионов Na+ и Рн; в плазме крови, напротив, содержание Na+ и Са2+ снижалось, а концентрация K+, Mg2+ и Рн повышалась. Изменения содержания электролитов в плазме крови достоверно отражают их сдвиги как в межклеточной жидкости, так и в тканях. В эритроцитах у представителей Б В подгрупп 1А и 1Б выявлено падение уровня АТФ, в то время как в подгруппах 2А и 2Б оно статистически значимо было более выраженным. Уменьшение содержания АТФ сопровождается накоплением АДФ и АМФ. Изменения компонентов адениловой системы приводят к падению величин ЭЗЭ, АТФ/АДФ, коэффициента К, увеличению фосфатного потенциала и суммы адениловых нуклеотидов. Низкое значение ЭЗЭ, определяющее, с одной стороны, возможность энергетической системы поддерживать необходимый уровень синтеза макроэрга, а с другой - активность распада последнего в результате усиленного расхода на энергетические потребности, указывает на нарушение процессов генерации энергии. Малейшее снижение ЭЗЭ приводит к ускорению реакций, вызывающих накопление АТФ, с одновременным торможением использования макроэрга. Степень снижения ЭЗЭ в клетке зависит от интенсивности воздействия экотоксикантов. Так, величина ЭЗЭ в момент исследования в подгруппах 2А и 2Б составила 82-85% по отношению к контролю, в то время как в подгруппах 1А и 1Б разница не была статистически значимой. Это свидетельствует о том, что у людей, работающих в условиях производства с постоянным контактом со смесью хлорированных и ароматических углеводородов, преобладают энергопотребляющие процессы, направленные на покрытие возникших энергетических потребностей, связанных в свою очередь с детоксикацией и Таблица 1 Изменение содержания α-токоферола (мкМ/л) и витамина С (нМ/мл) в плазме крови и слюне обследованных (р >0,05) Статистические показатели Изучаемые показатели, M±m Плазма крови Слюна α-токоферол витамин С α-токоферол витамин С Контрольная группа 22,12±2,52 44,20±4,24 10,36±2,44 26,12±3,63 Подгруппа 1А Подгруппа 2А 22,86±2,96 21,44±2,44 45,65±5,33 42,46±4,75 10,18±2,52 10,52±2,77 25,84±3,26 26,66±4,11 Подгруппа 1Б Подгруппа 2Б 22,86±2,96 20,73±2,08 45,65±5,33 41,73±4,46 10,18±2,52 10,05±2,33 25,84±3,26 25,27±3,43 выведением ксенобиотиков из организма. Крайне низкая величина ЭЗЭ может служить достаточно веским информативно-прогностическим признаком, позволяющим судить о степени патологических изменений в организме. В то же время в эритроцитах у обследуемых выявлены разнонаправленные изменения активности транспортных АТФаз, ключевых ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути (рис. 5). Если активность Na+,K+-зависимой АТФазы, глицероальдегидфосфатдегидрогеназы и глюкозо-6фосфатдегидрогеназы в основных группах (А и Б) повышалась, то активность Ca2+-и Mg2+-зависимой АТФазы, гексокиназы, фосфофруктокиназы и пируваткиназы, напротив, была снижена. Максимальные сдвиги в энергетической системе эритроцитов отмечены в подгруппах 2А и 2Б . Это может указывать на энергетический дефицит, который способен перерасти в «энергетическое голодание». Следовательно, можно полагать, что повышение концентрации АДФ и АМФ у лиц из подгрупп 1А и 1Б и, особенно, 2А и 2Б служит механизмом, компенсирующим необходимость усиленного синтеза АТФ. Свидетельством интенсивного синтеза макроэргов в эритроцитах является гиперфосфатемия. Увеличение содержания Рн в крови в результате усиленного распада АТФ в ряде органов и тканей направлено на активацию процесса, катализируемого глицероальдегидфосфатдегидрогеназой, в результате которого образуется 1,3-дифосфоглицерат. Накопление этого продукта приводит к ускорению синтеза макроэргов в ходе фосфоглицераткиназной реакции гликолиза, так как один из пусковых механизмов усиления указанной реакции - активация Na+,K+-АТФазы. Усиление её активности и снижение количества АТФ можно рассматривать как компенсаторную реакцию в условиях повышенного транспорта катионов. В литературе есть сведения о сдвиге тиолдисульфидного равновесия в сторону окисленных форм при действии различных химических загрязнителей. Это даёт основание полагать, что одна из возможных причин снижения активности Ca2+-и Mg2+зависимой АТФазы - блокирование тиоловых групп белковой молекулы. Данное предположение подтверждается в известной мере теорией Г.И. Сидоренко и Р.В. Меркурьевой (1991) о том, что универсальным и неспецифическим патогенетическим моментом проявления действия токсических веществ является альтерация мембран. У людей, контактирующих с ароматическими и хлорированными углеводородами, эритроциты обладают повышенной резистентностью к кислотному гемолитику, что проявляется на эритрограммах смещением пика наибольшего лизиса эритроцита вправо. Высокую резистентность имели эритроциты у рабочих из подгрупп 1А и 1Б, где количество существенно отличающихся от контроля показателей кислотной резистентности эритроцитов возрастало до 9. В подгруппах 2А и 2Б зарегистрировано снижение показателей кислотной резистентности эритроцитов, статистически значимо отличающееся от контроля по пяти точкам. Сдвиги кислотной резистентности эритроцитов закономерно зависели от стажа работы. При изучении осмотической резистентности эритроцитов выявлено, что количество разрушающихся в гипотоническом растворе 0,38% NaСl эритроцитов в основных группах обследуемых существенно превышало исходное значение. Во всех обследуемых основных группах в показателях антипириновой пробы существенных отклонений по сравнению с нормой не обнаружено. Период полувыведения антипирина в контрольной группе составил 10,55±1,5 ч, а клиренс антипирина - 42,54±2,4 мл/кг в час. Показатели антипириной пробы в подгруппах 1А и 1Б определялись на уровне 10,48±2,4 ч и 41,95±3,3 мл/кг в час, а в 2А и 2Б - соответственно 11,74±4,6 ч и 46,24±6,2 мл/кг в час. При внутригрупповом сравнении показателей ацетилирования изониазида статистически значимые различия выявлены лишь в подгруппах 2А и 2Б. В контрольной и основных профессиональных группах были выделены «быстрые», «средние» и «медленные» ацетиляторы в зависимости от степени инактивации изониазида. Так, если в контрольной группе основную часть составили «средние» (65%) и «медленные» (33%) ацетиляторы, то в группах А и Б наблюдали уменьшение числа лиц со средней скоростью ацетилирования. В частности, в подгруппах 1А и 1Б доля «средних», «медленных» и «быстрых» ацетиляторов составила 48, 42 и 10% , а в подгруппах 2А и 2Б - соответственно 33, 31 и 36%. Средний уровень выделения продуктов метаболизма изониазида с мочой статистически значимо отличался от контроля в подгруппах 2А и 2Б. Общая сумма выведенных соединений (неметаболизированый + ацетилированный изониазид) у представителей подгрупп 2А и 2Б с быстрым ацетилированием составила 38,3±4,2% при норме 63,1±5,8% (р <0,001), со средним ацетилированием - 41,5±3,6% при норме 52,4±4,4% (р <0,05). Изменения касались в основном уменьшения содержания ацетилированного изониазида, в то время как выделение не изменённого препарата было практически одинаковым во всех группах. ВЫВОДЫ Патогностические критерии в отношении воздействия химических загрязнителей - показатели хемилюминесценции плазмы крови, смешанной слюны и мочи. К высокоинформативным параметрам начальной стадии воздействия химических загрязнителей относятся процессы нарушения свободнорадикального окисления с регистрацией хемилюминесценции плазмы крови, смешанной слюны и мочи. К высокоинформативным показателям выраженной стадии воздействия химических загрязнителей относятся стойкие изменения состояния адениловой и монооксигеназной систем, ферментного спектра и дисбаланс ионов крови. Исследования систем свободнорадикального и микросомального окисления, антиоксидантной системы, энергетического и электролитного обмена представляются целесообразными в прогностическом смысле для количественной оценки активности окислительных процессов в организме

About the authors

E F Galiullina

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

Email: rustam6274@mail.ru

R F Kamilov

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

D F Shakirov

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

R T Bulyakov

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

References

Supplementary files