Гепатопротективная активность нового германийорганического биологически активного вещества (медгерм) при экспериментальном гепатите

Полный текст

Свободные радикалы и продукты перекис-как этиотропной, так и патогенетической ного окисления липидов (ПОЛ) играют важ-фармакотерапии. Одной из основных задач ную роль в патогенезе острых и хронических патогенетической составляющей лечения гегепатитов различной этиологии [1]. Баланс патитов является предупреждение или устрамежду ПОЛ и антиоксидантной системой нение одного из ведущих звеньев механизма (АОС) - условие, необходимое для поддержа-поражения печени - дестабилизации морфония нормальной жизнедеятельности клетки. функционального состояния мембран гепато Современная фармакотерапия острых и цитов, связанной со свободнорадикальным хронических болезней печени характеризу-окислением [7]. ется применением лекарственных средств Несмотря на достаточно большой арсе нал гепатопротекторов, они не всегда до Адрес для переписки: olt2006@mail.ru статочно эффективны, поэтому разработка новых препаратов гепатопротективного действия остаётся актуальной проблемой гепатофармакологии [10]. В последнее время значительное развитие получили исследования фармакологических свойств германийорганических соединений [5, 14]. Проведённые доклинические и клинические испытания комплексных германийсодержащих соединений показали, что они положительно влияют на организм, имея разносторонние фармакодинамические свойства (гепато-, нейро-, кардиопротективное, антигипоксическое и др.) [13]. Особый интерес германий представляет в комплексных соединениях с различными биолигандами [5], среди которых особое внимание занимает оксиэтилидендифосфоновая кислота. Наряду с низкой токсичностью она обладает высокой биологической активностью, её производные достаточно широко применяют в клинической практике как регуляторы минерального обмена, противоопухолевые средства, антидоты при отравлении токсичными и радиоактивными элементами и т.д. [11, 12]. По этой причине целенаправленным синтезом был создан новый класс биологически активных веществ - оксиэтилидендифосфонатогерманатов. Как одно из перспективных веществ в этом ряду можно рассматривать комплексное соединение германия и оксиэтилендифосфоновой кислоты с эссенциальным микроэлементом медью - купрум-оксиэтилиден-дифосфонато-германат (лабораторный шифр - медгерм). Интерес к меди обусловлен тем, что она играет большую роль в поддержании морфофункциональной структуры миелиновых оболочек нервов, кровеносных сосудов, лёгочных альвеол и пр. Кроме того, медь влияет на углеводный обмен, процессы кроветворения, способствует усвоению железа, входит в состав многих важных ферментов, таких как Cu/Zn-супероксиддисмутаза (Cu/ Zn-СОД), цитохромоксидаза, тирозиназа, аскорбиназа и другие, обладает противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами [4, 6]. В метаболизме меди большую роль играет печень, где синтезируется медьсодержащий белок церулоплазмин, обладающий различными биологическими свойствами [2]. Всё это и обусловило цель данного исследования - изучение влияния медгерма на состояние ПОЛ и АОС у крыс при остром галактозаминовом гепатите. Опыты проводили на крысах-самцах линии Вистар с массой тела 180-220 г, разведённых в виварии Одесского национального медицинского университета. Животных содержали в обычных условиях на стандартном пищевом и водном рационе. Острый токсический гепатит у крыс вызывали путём внутрибрюшинного (в/б) введения D-галактозамина из расчёта 400 мг/кг в виде 20% водного раствора (полулетальная доза) [8]. Ранее было показано, что для изучения новых гепатопротекторов с предполагаемой мембранотропной активностью наиболее показательна галактозаминовая модель поражения печени, поскольку она протекает, во-первых, «мягче», во-вторых, с привлечением практически всех патогенетических механизмов, наблюдаемых при гепатитах различной этиологии, в том числе вирусной [3]. Экспериментальные животные были распределены на четыре группы: первая группа (n=10) - интактные животные, которым в/б вводили в течение всего времени наблюдения 0,9% раствор натрия хлорида (контрольная группа); вторая группа (n=40) - животные, которые получали только D-галактозамин; третья группа (n=40) - крысы, которым в/б вводили медгерм в дозе 0,4 мг/кг в течение 7 сут до введения и 7 сут после введения D-галактозамина. Доза и режим введения медгерма были определены ранее [9]. Четвёртую группу (n=40) составили крысы, которым в таком же режиме в/б вводили препарат сравнения эссенциале® Н («Авентис Фарма Дойчланд ГмбХ», «Эй. Наттерман энд Сайи ГмбХ», Германия) в дозе 5 мг/кг. Исследование показателей ПОЛ и АОС проводили в 1-е, 3-и, 5-е и 7-е сутки после введения гепатотоксина в сыворотке крови (СК) и супернатанте гомогената ткани печени (ТП). Состояние процессов ПОЛ у животных с галактозаминовым гепатитом оценивали по содержанию в крови и ТП конечных продуктов ПОЛ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-Р). Состояние основных компонентов АОС оценивали по уровню одного из основных компонентов её неферментативного звена - глутатиона восстановленного (по G.L. Ellman, 1959), а также по активности двух ключевых ферментов её энзимной составляющей - каталазы (по М.А. Королюк, 1988) и СОД (по В.А. Костюк и соавт., 1990). При расчётах содержания анализируемых веществ и активности ферментов в ТП учитывали массу ТП и степень разведения гомогената. Статистическую обработку полученных данных проводили, используя программу Мiсrosoft Excel, методом вычисления среднего арифметического и уровня его статистической значимости по критерию достоверности Стьюдента. Проведённые исследования показали, что у животных второй группы в 1-е сутки острого галактозаминового гепатита происходило резкое повышение уровня ТБК-Р (СК - в 2,49 раза, ТП - 3,47 раза), уменьшалось содержание восстановленного глутатиона (СК - на 53,5%, ТП - на 59,8%), снижалась активность каталазы (в обоих субстратах на 30,0%) и СОД (в СК - на 58,3%, в ТП - на 49,2%) по сравнению с животными первой группы (табл. 1, 2). У крыс третьей и четвёртой групп в тот же период гепатита происходили аналогичные по направленности изменения, но их выраженность была значительно меньшей. По сравнению с животными первой группы у крыс третьей группы уровень ТБК-Р повышался в СК только на 23,7%, а в ТП - на 33,6%; содержание восстановленного глутатиона уменьшалось в СК на 44,0%, в ТП - на 26,6%; активность каталазы снижалась в СК на 9,2%, в ТП - на 21,4%; активность СОД уменьшалась в СК на 16,3%, в ТП - на 19,1% (см. табл. 1, 2). У крыс четвёртой группы по сравнению с контрольной уровень ТБК-Р повышался в СК на 49,2%, в ТП - на 64,9%; содержание восстановленного глутатиона уменьшалось в СК на 44,7%, в ТП - на 36,4%; активность каталазы снижалась в СК на 25,9%, в ТП - на 28,5%; активность СОД уменьшалась в СК на 47,3%, в ТП - на 31,6% (см. табл. 1, 2). Как свидетельствуют данные таблиц, динамика изучаемых показателей при остром галактозаминовом гепатите в каждой опытной группе имела свои особенности. Так, у животных второй группы изменения изучаемых показателей в СК и в ТП были самыми выраженными и достоверно отличались от показателей крыс контрольной группы вплоть до 7-го дня наблюдения. У животных третьей группы на фоне профилактически-лечебного введения медгерма выраженность патологических изменений изучаемых показателей была значительно меньше, а их восстановление к исходным значениям контрольных крыс происходило намного раньше, чем у нелеченых животных второй группы. Так, повышение содержания ТБК-реактатнтов и в СК, и в ТП было достоверным только до 3-х суток наблюдения, а к 5-м суткам гепатита и в СК, и в ТП их содержание прибли Таблица 1 Содержание веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-Р), и глутатиона восстановленного в сыворотке крови (СК) и ткани печени (ТП) крыс разных опытных групп, M±m День гепатита Содержание ТБК-Р Содержание восстановленного глутатиона СК, нмоль/л ТП, нмоль/г СК, мкмоль/л ТП, мкмоль/г Первая группа (контроль) 27,81±1,67 0,31±0,01 54,1±3,13 155,35±8,10 Вторая группа (нелеченый гепатит) 1-й 69,2±3,11* 1,08±0,05* 25,15±1,30* 62,50±3,13* 3-й 57,19±2,90* 0,78±0,04* 26,04±0,52* 54,61±2,18* 5-й 53,04±2,70* 0,46±0,02* 29,30±1,79* 81,64±2,45* 7-й 42,79±2,11* 0,41±0,01* 36,86±0,88* 113,93±5,70* Третья группа (гепатит на фоне в/б введения медгерма в дозе 0,4 мг/кг) 1-й 34,39±1,42* 0,41±0,02* 30,31±1,55* 114,22±5,70* 3-й 32,20±0,98* 0,39±0,02* 35,2±0,70* 133,48±5,32* 5-й 28,68±1,16 0,33±0,02 45,57±2,36* 145,29±4,36 7-й 27,35±0,90 0,31±0,01 53,17±2,71 160,34±8,02 Четвёртая группа (гепатит на фоне в/б введения эссенциале® Н в дозе 5 мг/кг) 1-й 41,5±1,10* 0,5±0,03* 29,92±1,50* 98,82±4,94* 3-й 41,02±2,12* 0,39±0,02* 31,87±1,14* 122,17±4,90* 5-й 33,75±1,76* 0,34±0,02 36,39±1,83* 124,25±3,71* 7-й 30,13±1,52 0,31±0,01 43,91±2,25* 138,49±6,89 Примечание: ТБК - тиобарбитуровая кислота; в/б - внутрибрюшинное; *р <0,05 по сравнению с показателями крыс контрольной группы. жалось к референтным значениям. Содержание восстановленного глутатиона в СК было достоверно снижено и к 5-м суткам наблюдения, а в ТП уже к 3-м суткам острого галактозаминового гепатита приближалось к значениям контрольных животных. Уменьшение активности каталазы в СК достоверно отличалось от аналогичного показателя крыс первой группы только на 1-е сутки наблюдения, а на 5-е сутки острого гепатита активность каталазы укладывалась в референтный интервал и в ТП. Активность СОД в СК и ТП к 5-м суткам острого галактозаминового гепатита не отличалась от контрольных значений. У крыс четвёртой группы на фоне профилактически-лечебного введения эссенциале® Н снижение содержания ТБКреактатнтов в СК и ТП было достоверным вплоть до 5-х суток эксперимента. Содержание восстановленного глутатиона в СК и ТП даже к 7-м суткам наблюдения оставалось достоверно меньше, чем у животных контрольной группы. Активность каталазы в СК только к 7-м суткам укладывалась в референтные границы, а в ТП - к 5-м суткам. Активность СОД в СК и на 7-е сутки всё ещё была достоверно снижена, а в ТП восстановление активности СОД наступило только на 7-е сутки острого галактозаминового гепатита (см. табл. 1, 2). Таким образом, оценивая характер влияния координационного соединения германия с медью на состояние прооксидантноантиоксидантного гомеостаза при остром токсическом галактозаминовом гепатите, необходимо отметить его способность достаточно эффективно предупреждать генерацию и накопление конечных продуктов ПОЛ, а также сохранять активность неферментативной и ферментативной частей АОС. Всё это в конечном итоге обеспечивает предупреждение нарушения функций мембран гепатоцитов, а следовательно, и уменьшение токсического влияния гепатотоксиканта на печень. Убедительным свидетельством этого служит предупреждение образования и накопления в 1-е сутки острого галактозаминового гепатита конечных продуктов ПОЛ (ТБК-Р) у крыс третьей группы в отличие от нелеченых животных второй группы. При этом у животных, которые получали медгерм, уровень ТБК-Р был значительно меньшим, чем у животных второй группы, как в СК, так и в ТП (соответственно в 2,0 и 2,6 раза). Подобная картина у крыс второй группы зарегистрирована при изучении неферментативного и ферментативного звеньев АОС. У животных, предварительно получавших медгерм, в 1-е сутки острого токсического галактозаминового гепатита Таблица 2 Активность каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке крови (СК) и ткани печени (ТП) крыс разных опытных групп, M±m День гепатита Активность каталазы Активность СОД СК, кат/л ТП, кат/г СК, у.е. ТП, у.е./г Первая группа (контроль) 152,14±6,12 1065,00±14,55 63,72±5,05 0,33±0,02 Вторая группа (нелеченый гепатит) 1-й 106,94±5,45* 731,66±36,58* 26,57±1,04* 0,17±0,01* 3-й 110,01±3,41* 836,56±33,46* 28,12±1,04* 0,16±0,01* 5-й 120,27±1,20* 881,18±26,44* 32,64±2,38* 0,20±0,01* 7-й 124,37±6,22* 938,69±46,93* 42,95±2,58* 0,27±0,01* Третья группа (гепатит на фоне в/б введения медгерма в дозе 0,4 мг/кг) 1-й 138,14±3,87* 837,09±41,85* 53,33±2,67* 0,27±0,01* 3-й 144,82±6,52 949,02±37,96* 56,15±2,81* 0,26±0,01* 5-й 147,71±5,61 999,72±29,99 58,48±0,64 0,30±0,02 7-й 154,03±2,93 1050,94±52,55 63,49±2,73 0,33±0,01 Четвёртая группа (гепатит на фоне в/б введения эссенциале® Н в дозе 5 мг/кг) 1-й 112,67±5,63* 762,01±38,10* 33,56±1,68* 0,23±0,01* 3-й 114,27±5,71* 853,38±34,14* 37,73±1,89* 0,24±0,01* 5-й 121,32±6,31* 1007,06±30,21 43,43±2,17* 0,29±0,01* 7-й 136,06±6,80 1089,46±54,47 52,09±2,03* 0,30±0,01 Примечание: у.е. - условные единицы; *р <0,05 по сравнению с показателями крыс контрольной группы. отмечено значимое уменьшение содержания восстановленного глутатиона и активности каталазы. Однако у крыс третьей группы эти патологические изменения были значительно меньшими, чем у крыс второй группы. Кроме этого, у животных, получавших медгерм, показатели ПОЛ и АОС быстрее восстанавливались до исходного уровня по сравнению с аналогичными показателями у нелеченых крыс второй группы. D-галактозамин вызывает инициирование ПОЛ, что ведёт к истощению АОС клеток и нарушению функционирования плазматических, митохондриальных мембран и мембран эндоплазматического ретикулума. Полученные результаты при профилактически-лечебном применении изучаемого биологически активного вещества при остром токсическом гепатите, вызванном D-галактозамином, свидетельствуют об антиоксидантной активности медгерма и его опосредованном мембранопротективном действии. Следует подчеркнуть, что исследуемое биологически активное вещество проявляет сходную антиоксидантную активность с препаратом сравнения - эссенциале® Н. ВЫВОД На основании полученных данных можно сделать вывод, что в основе механизма гепатопротективного действия исследуемого германийорганического комплекса, скорее всего, лежит его способность реализовать антиоксидантные и антирадикальные свойства, предупреждая таким образом избыточный расход запасов эндогенных антиоксидантов и одновременно снижая чрезмерное образование активных форм кислорода, которые инициируют процесс перекисного окисления липидов.

Об авторах

Олег Львович Тымчишин

Одесский национальный медицинский университет

Email: olt2006@mail.ru

Список литературы

Дополнительные файлы