Adrenal gland pathology in rats after acute postnatal hypoxia

Full Text

Состояние острой гипоксии у плода и но-диагноза «острая гипоксия новорождённого» ворождённого способно развиться до, во время («острая асфиксия») у умерших новорождёни после родов, а причины могут иметь плацен-ных при материнской эклампсии может дотарное, плодовое и материнское происхож-стигать 57% [11]. дение: отслойка плаценты, узел пуповины, Выход плода и новорождённого из состопролонгация периода изгнания вследствие яния острой гипоксии после прекращения слабости родовых сил, обтурация просвета ды-действия фактора, обусловившего развитие хательный путей и пр. Частота постановки гипоксического состояния, может быть раз ным: с восстановлением нормального кли Адрес для переписки: reklama-kharkov@ukr.net нического состояния, с быстрым летальным исходом, с вхождением в период пролонгированного восстановления, который может закончиться или выздоровлением, или развитием декомпенсации с летальным исходом. Летальный исход зависит не только от тяжести асфиксии, но и от уровня развития перинатальной медицины в данной стране. В частности, в Нигерии в течение первого десятилетия XXI века 18,9% случаев ранней неонатальной смерти развились от тяжёлой асфиксии новорождённого [7]. Аналогичная ситуация была в российских регионах (Чувашия) в 2006 г. (19%), а затем произошло резкое снижение значений этого показателя (2007 г. - 13,79%, 2008 г. - 6,3%, 2009 г. - 4,6%), что, по мнению авторов, обусловлено успешной организационной деятельностью службы родовспоможения и детства [1]. Очевидно, что острую перинатальную гипоксию следует рассматривать как состояние, требующее срочных адаптационных изменений, в которых одну из важнейших ролей играет надпочечник, синтезирующий стрессорганизующие гормоны - катехоламины, и стресс-лимитирующие кортикостероиды. О том, что у новорождённого после острой асфиксии происходит повышение концентрации в крови адреналина, норадреналина и кортизола, хорошо известно [8-10]. Однако не очень понятно, за счёт каких морфологических ресурсов это происходит, остаётся ли в дальнейшей жизни «структурный след» этого высокого морфофункционального напряжения отдельных субъединиц надпочечника Цель исследования - изучить гистологические изменения надпочечников новорождённого крысёнка, перенёсшего острую постнатальную асфиксию, и «структурный след» в надпочечниках в течение первого месяца жизни. В качестве экспериментальных животных использовали крыс популяции Вистар. Перед постановкой эксперимента у крыс 2 раза измеряли артериальное давление для исключения спонтанной артериальной гипертензии. После получения новорождённого потомства крысят (20 особей от 5 самок-родильниц) помещали в колокол-барокамеру (имитация подъёма на высоту 3500 м с уменьшением атмосферного давления до 493 мм рт.ст.). Длительность сеанса составляла 5 мин. У крысят отмечали развитие выраженного цианоза кожных покровов и тахипноэ (реакция на острую гипоксию). Эти животные составили основную группу (острая постнатальная гипоксия). Летальных исходов не было. Выведение крыс из эксперимента путём декапитации осуществляли в 1-й день (через 1 ч после моделирования острой постнатальной гипоксии, 7 особей), через 7 дней (7 особей) и через 35 дней (6 особей), что соответствует периоду раннего детства у человека. Одновременно интактные крысята составили группу контроля в такой же динамике и в таком же количестве. Выведение животных из эксперимента проводили согласно условиям эвтаназии, указанным в методических рекомендациях МЗ Украины, и общим этическим принципам проведения экспериментов на животных согласно положениям «Европейской конвенции о защите позвоночных, которых использовали для экспериментальных и иных целей». У потомства крыс брали оба надпочечника, усредняя результаты. После фиксации в 10% формалине надпочечники заливали в парафин. Готовили микропрепараты, окрашенные гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, галлоцианином с хромовыми квасцами по Эйнарсону на суммарные нуклеиновые кислоты. Кроме гистологического описания микропрепаратов, провели иммуногистохимическое исследование с моноклональными антителами к каспазе-3 (в качестве маркёра апоптоза) и Ki67 (маркёру пролиферации, фирма «Dako»). Морфометрическое исследование осуществлено на компьютерных изображениях: определены толщина зон коры и площадь мозгового вещества, определена площадь ядер эндокриноцитов во всех зонах коры и в мозговом веществе надпочечников. Микроскопирование осуществляли на микроскопе «Olympus-BX-41» (Япония), морфометрические исследования - с использованием программы «Olympus DP-Soft» (version 3.1). Морфометрические данные обработаны методами вариационной и альтернативной статистики [3, 6]. У новорождённых крыс контрольной группы основную толщину коры надпочечников составила фетальная кора. Клубочковая зона хорошо дифференцировалась от пучковой зоны в связи с наличием между ними слоя малодифференцированных камбиальных клеток, имеющих тёмное ядро и малообъёмную цитоплазму. В клубочковой зоне только местами видны чётко сформированные аркадные структуры. Многие кортикоциты клубочковой зоны имеют относительно светлое ядро с многочисленными мелкими глыбками хроматина, а их цитоплазма - эозинофильная, мало вакуолизированная, что соответствует картине активного синтеза и выведения стероидного гормона (альдостерона). Пучковая зона коры надпочечников у новорождённых крысят контрольной группы оставалась узкой, лишь приблизительно в 2 раза толще клубочковой зоны. Эндокриноциты пучковой зоны имели также глыбчатый хроматин в ядре и эозинофильную цитоплазму. Как указано выше, преобладала фетальная кора, и её эндокриноциты также морфофункционально активны. В мозговом веществе присутствовали как морфофункционально активные, зрелые нейроэндокриноциты со светлым эухромным ядром и эозинофильной зоны по сравнению с контрольной группой увеличивалась в 2 раза, но, видимо, многие спонгиоциты ещё не достигли морфофункционального уровня зрелой клетки, и площадь ядра спонгиоцита в среднем была достоверно меньше, чем в контрольной группе (табл. 1). Такое изменение микроскопической картины пучковой зоны, очевидно, произошло в связи с уже прошедшей быстрой, мощной пролиферацией камбиальных клеток, находящихся на границе с клубочковой зоной. В большинстве участков пучковой зоны Ki67-положительные клетки были единичны Таблица 1 Результаты морфометрического исследования надпочечников крыс в возрасте 1 день Клубочковая зона Пучковая зона Фетальная кора Мозговое вещество Ширина зоны, мкм Площадь ядра эндокриноцита, мкм2 Ширина зоны, мкм Площадь ядра эндокриноцита, мкм2 Ширина зоны, мкм Площадь ядра эндокриноцита, мкм2 Площадь мозгового вещества, мм2 Площадь ядра, мкм2 Контроль ная группа 30,7±1,3 14,00±0,42 108,4±4,3 14,48±0,35 152,9±6,6 13,16±0,64 0,534±0,024 10,85±0,60 (n=7) Основная группа (n=7) 32,0±1,7 14,32±0,46 207,8±10,2* 11,48±0,51* 103,5±4,7* 8,06±0,94* 0,228±0,012* 14,46±0,24* Примечание: *р ≤0,05 в сравнении со значениями контрольной группы. цитоплазмой, так и незрелые симпатогонии, имеющие темноватое небольшое ядро и узкий ободок цитоплазмы. Процесс формирования мозгового вещества у новорождённых крысят контрольной группы ещё продолжался, так как в коре надпочечников встречались «дорожки» из симпатогоний, идущие от оболочки надпочечника к мозговому веществу. Кроме того, в околонадпочечниковой жировой ткани обнаружены разного размера группы симпатогоний, ещё не мигрировавших в мозговое вещество. У животных основной группы в первые часы после моделирования острой гипоксии гистологическая структура надпочечников существенно отличалась от таковой у крысят контрольной группы. Клубочковая зона коры надпочечников выглядела более рыхлой, при этом толщина зоны и размер ядер эндокриноцитов достоверно не изменились, то есть можно предположить, что часть эндокриноцитов погибла путём апоптоза «за ненадобностью» [5], так как в процессе адаптации к любым стрессогенным условиям синтез альдостерона подавляется [2]. Формирующаяся пучковая зона в момент выведения животного из эксперимента имела своеобразную форму «кустов», или «пирамид», вершиной направленных к мозговому веществу. Ширина пучковой ми или вообще отсутствовали, как и в контрольной группе. При этом практически в каждом случае основной группы, в отличие от контрольной, были обнаружены участки пучковой зоны с большим количеством таких клеток, индекс пролиферации в пределах поля зрения в этих участках при увеличении в 400 раз варьировал от 5 до 40% (рис. 1). Обращает на себя внимание, что в участках сохраняющейся повышенной пролиферативной активности эндокриноцитов пучковой зоны присутствовали очаги цитолиза эндокриноцитов с образованием пустот (см. рис. 1). Сопоставляя эти два факта, можно объяснить произошедшие изменения тем, что приспособление к острой постнатальной гипоксии обусловило увеличение потребности организма в кортикостероидах по сравнению с животными, переживающими только приспособление к внеутробной жизни. В результате, вероятно, апоптоз кортикоцитов пучковой зоны был более многочисленным, а в ответ происходила более активная и продолжительная пролиферация. Регистрируемая многими авторами гиперкортизолемия у новорождённых детей, перенёсших острую асфиксию, и гиперкортикостеронемия у экспериментальных животных при моделировании острой постнатальной асфиксии, как Рис. 1. Группа пролиферирующих кортикоцитов (Ki-67-положительные кортикоциты имеют коричневое ядро) в коре надпочечников у 1-дневного новорождённого крысёнка основной группы. Иммуногистохимическая реакция. Увеличение 400. показало настоящее исследование, реализуется резкой гиперплазией пучковой зоны, а не повышением морфофункциональной активности отдельного спонгиоцита. Фетальная кора уменьшена по ширине, меньше и средняя площадь ядра, что указывает на понижение морфофункциональной активности фетальной коры надпочечника по сравнению с группой контроля и, очевидно, свидетельствует об ускоренном созревании надпочечника под действием перенесённой острой нетяжёлой (так как животные остались живы) постнатальной гипоксии. Мозговое вещество надпочечников стало менее объёмным, клеточные комплексы размещены рыхло. Многие нейроэндокриноциты имеют вакуолизированную цитоплазму, а ядра в среднем достоверно крупнее, чем в контрольной группе (см. табл. 1). Такая картина мозгового вещества надпочечников свидетельствует о недавнем резком уменьшении количества нейроэндокриноцитов в мозговом веществе, что может быть связано с форсированным апоптозом многих нейроэндокриноцитов, активно синтезирующих катехоламины во время эпизода острой постнатальной гипоксии. О продолжающемся массированном апоптозе нейроэндокриноцитов в мозговом веществе свидетельствует наличие большого количества каспаза-3-положительных нейроэндокриноцитов (рис. 2): если в контрольной группе их было 14,3±2,7%, то в основной группе - 27,5±5,6% (р ≤0,05). На 14-е сутки после рождения надпочечники крысят обеих групп значительно увеличились в размерах. В этот срок фетальная кора исчезла, появилась узкая сетчатая зона коры. В надпочечниках животных контроль Рис. 2. Многочисленные каспаза-3-положительные нейроэндокриноциты (коричневый цвет) в мозговом веществе надпочечника у 14-дневного новорождённого крысёнка основной группы свидетельствуют о форсированном апоптозе этих клеток через 2 нед после перенесённой острой гипоксии. Иммуногистохимическая реакция. Увеличение 400. ной группы аркадные структуры клубочковой зоны уже хорошо оформлены, пучковая зона чётко очерчена. Эндокриноциты клубочковой и пучковой зон имеют признаки умеренного уровня функционирования: их ядра умеренно эухромные, а вакуолизация цитоплазмы существенна. Мозговое вещество также имеет признаки созревания, поскольку значительно увеличено количество активно функционирующих нейроэндокриноцитов, при этом в цитоплазме присутствуют значительные запасы гормонов, о чём свидетельствует наличие объёмных прозрачных вакуолей. У крыс основной группы на 14-е сутки постнатальной жизни гистологические отличия коры надпочечников можно оценить как гиперактивность пучковой зоны, так как она существенно шире, чем в контрольной группе, спонгиоциты в этой зоне расположены плотно, компактно. По данным кариометрии размеры ядер спонгиоцитов в среднем не отличались от таковых в контрольной группе (табл. 2). Иммуногистохимическое исследование показало наличие увеличенного количества Ki-67-позитивных эндокриноцитов в пучковой зоне коры надпочечников у крыс основной группы (5,5±1,2% против 0,5±0,4% в контрольной группе), что свидетельствует о продолжающейся активной пролиферации клеток этой зоны. Сетчатая зона коры надпочечников животных основной группы имеет признаки значительного снижения морфофункциональной активности по сравнению с крысятами контрольной группы, так как она значительно уже, а ядра эндокриноцитов - достоверно меньше, чем в контроле. Клубоч Таблица 2 Результаты морфометрического исследования надпочечников крыс в возрасте 14 дней Клубочковая зона Пучковая зона Сетчатая зона Мозговое вещество Ширина зоны, мкм Площадь ядра эндокриноцита, мкм2 Ширина зоны, мкм Площадь ядра эндокриноцита, мкм2 Ширина зоны, мкм Площадь ядра эндокриноцита, мкм2 Площадь мозгового вещества, мм2 Площадь ядра, мкм2 Контрольная группа (n=7) 41,5±1,2 12,05±0,31 222,1±9,5 16,52±0,50 170,5±7,7 18,81±0,67 1,306±0,060 12,33±0,61 Основная группа (n=7) 45,2±1,3 14,39±0,32* 307,5±12,2* 16,68±0,34 70,7±4,1* 16,93±0,56* 1,350±0,074 14,43±0,40* Примечание: *р ≤0,05 в сравнении со значениями контрольной группы. ковая зона коры надпочечников выглядит рыхлой, но ядра эндокриноцитов увеличены, цитоплазма мало вакуолизирована. Мозговое вещество надпочечников на 14-й день жизни крыс после перенесённой острой асфиксии так же, как и пучковая зона коры, стимулировано: его площадь несколько больше, чем в контрольной группе (но недостоверно), а в динамике, то есть относительно состояния в 1-й день, оказывается восстановившимся «с избытком». Если адаптация к острой гипоксии потребовала значительного синтеза катехоламинов, и при этом происходил апоптоз многих нейроэндокриноцитов, то за 14 последующих суток произошло восстановление клеточного пула путём миграции незрелых симпатогоний снаружи капсулы надпочечника через его кору к центру надпочечника, то есть в мозговое вещество, что мы и наблюдали у крысят, выведенных из эксперимента в возрасте 1 сут. Кариометрия показала увеличение средней площади ядер нейроэндокриноцитов по сравнению с группой контроля, что указывает на сохранение повышенной морфофункциональной активности нейроэндокриноцитов мозгового вещества у крысят на 14-е сутки постнатальной жизни. Цитоплазма нейроэндокриноцитов часто содержит мелкие и крупные прозрачные вакуоли, то есть у крысят формируется запас катехоламинов. Исследование уровня апоптоза с выявлением каспаза-3-позитивных нейроэндокриноцитов мозгового вещества позволило подтвердить более активный апоптоз в мозговом веществе у животных основной группы (3,8±1,2% против 0,8±0,4% в контрольной группе, р ≤0,05). На 35-й день постнатальной жизни (табл. 3) надпочечники крыс контрольной группы продолжали увеличиваться в размерах, имели гистологические признаки полностью сформировавшихся и функционирующих на среднем уровне с признаками возможности срочного повышения функций при необходимости, так как существенная часть кортикоэндокриноцитов содержала запасы холестерина в цитоплазме, а нейроэндокриноцитов мозгового вещества - запасы катехоламинов в цитоплазме. У крысят основной группы на 35-й день жизни (через 35 сут после перенесённой острой гипоксии) надпочечники были в среднем крупнее, чем в контрольной группе. Зоны коры надпочечника чётко различались: клубочковая и, особенно, пучковая зоны шире, чем в контрольной группе, а сетчатая - у́ же (см. табл. 3). В клубочковой зоне эндокриноциты были расположены компактно, образуя характерные «аркады», многие эндокриноциты имели крупное светлое ядро. Пучковая зона коры надпочечника производила впечатление гиперплазированной по сравнению с контрольной группой; спонгиоциты также были размещены в трабекулах компактно, среди них многие имели крупное ядро, эозинофильную цитоплазму. Встречались группы эндокриноцитов малой клеточной площади и с темноватым гиперхромным ядром. При постановке иммуногистохимической реакции с антителами Ki-67 именно такие клетки оказались мечеными, тогда как в контрольной группе единичные пролиферирующие клетки обнаруживались только вдоль камбиального слоя. Статистически значимые различия среднего индекса пролиферации в корковом веществе надпочечников крыс двух групп сроке 35 дней не выявлены (контрольная группа - 1,7±1,2%, основная группа - 2,9±1,8%). Сетчатая зона коры надпочечника в основной группе у́ же, чем в контрольной группе, ядра эндокриноцитов в среднем крупнее. Мозговое вещество надпочечника в основной группе занимало меньшую площадь на «экваториальном» срезе, то есть оно менее объёмное, чем в контрольной группе, синусоиды шире, поэтому можно предположить, что на этом сроке уже начинается атрофия мозгового вещества. Кариометрия показала, что в среднем ядра нейроэндокриноцитов крупнее, чем в контрольной группе, что, вероятно, носит компенсаторный характер. Довольно ча Таблица 3 Результаты морфометрии надпочечника крыс в возрасте 35 дней Клубочковая зона Пучковая зона Сетчатая зона Мозговое вещество Ширина зоны, мкм Площадь ядра эндокриноцита, мкм2 Ширина зоны, мкм Площадь ядра эндокриноцита, мкм2 Ширина зоны, мкм Площадь ядра эндокриноцита, мкм2 Ширина зоны, мкм Площадь ядра эндокриноцита, мкм2 Контроль ная груп 63,4±1,3 11,21±0,35 252,3±10,1 17,14±0,41 157,0±7,7 16,9±0,30 0,385±0,012 19,15±0,38 па (n=6) Основ ная группа 80,5±5,2* 17,83±0,45* 417,6±27,7* 18,37±0,22* 124,1±5,6* 20,46±0,48* 0,287±0,011* 21,87±0,42* (n=6) Примечание: *р ≤0,05 в сравнении со значениями контрольной группы. сто (5-6 в поле зрения при увеличении 400) встречались нейроэндокриноциты с пикнотичными ядрами. Иммуногистохимически показано значительное увеличение количества каспаза-3-положительных нейроэндокриноцитов (10,5±4,1%) по сравнению с контрольной группой (2,2±1,1%, p ≤0,05). Интересной особенностью надпочечника крыс основной группы на сроке 35 дней было наличие большого количества крупных клеток с тёмным коричневым пигментом в цитоплазме, располагающихся по границе между мозговым веществом и корой. Появление меланоцитов в надпочечнике после перенесённой постнатальной острой гипоксии может быть обусловлено включением в гипофизарную стимуляцию надпочечника усиленного синтеза не только адренокортикотропного, но и меланоцит-стимулирующего гормона, синтезируемого промежуточной долей гипофиза. Таким образом, после перенесённой новорождённым крысенком острой асфиксии в его надпочечниках в течение изученного времени (до 35-дневного возраста) присутствуют гистологические, морфометрические и иммуногистохимические отличия от контрольных животных. Их суть состоит в гиперплазии пучковой зоны коры, гипоплазии сетчатой зоны, повышении морфофункциональной активности эндокриноцитов как пучковой, так и клубочковой зон, а также нейроэндокриноцитов мозгового вещества. Эндокриноциты надпочечника, резко стимулированные острой асфиксией в первые часы после рождения, быстрее «изнашиваются» и в последствии, когда этот эпизод сменился нормальными, одинаковыми с контрольными животными условиями существования. Клетки пучковой зоны коры в течение всего этого времени активнее делятся. Комплекс нейроэндокриноцитов мозгового вещества более активно пополнялся симпатогониями в ранние изученные сроки путём миграции их извне. При этом есть исследования, в которых обнаружено, что через 12-18 ч после острой постнатальной асфиксии повышенный уровень кортикостеронемии и пониженный дегидроэпиандростеронемии нормализуется [10] Как было указано выше, летальных случаев в данном эксперименте не было, поэтому сделан вывод о том, что уровень смоделированной асфиксии не оказался тяжёлым. Согласно результатам исследования T.A. Harris и соавт. [9], повышенный уровень кортизолемии прямо коррелирует с исходом ишемической энцефалопатии после острой гипоксии у новорождённых поросят. Если возможности надпочечника новорождённого по срочному синтезу стресс-организующих и стресс-лимитирующих гормонов окажутся исчерпанными, а уровень гормонов в крови - неадекватно низким, наступит ухудшение состояния с высокой вероятностью летального исхода [4]. ВЫВОДЫ Экспериментально на крысах линии Вистар установлено, что непродолжительный эпизод нетяжёлой гипоксии в ближайшее время после рождения крысёнка приводит к развитию характерных адаптационных изменений надпочечников: гиперплазии пучковой зоны коры, повышенной морфофункциональной активности нейроэндокриноцитов мозгового вещества на фоне апоптоза многих из них, торможения морфофункциональной активности эндокриноцитов клубочковой зоны и фетальной коры. В течение первого месяца жизни этих крысят происходит ускоренный апоптоз нейроэндокриноцитов мозгового вещества и спонгиоцитов пучковой зоны коры. Регенерация спонгиоцитов наблюдается не только в камбиальном слое, но и в толще пучковой зоны, что позволяет предположить не только физиологический её характер, но и репара тивный. Клеточная регенерация мозгового 2. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Кузьменко Т.С. Антистрессорные реакции и активационная терапия. - М.: вещества, видимо, происходит только в пер ИМЕДИС, 1998. - 565 с. вые дни после рождения путём миграции 3. Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., Маринкин В.И. симпатогоний снаружи надпочечника к его Прикладная медицинская статистика. - СПб.: Фолицентру, но в возрасте 35 дней уже появляются ант, 2003. - 432 с. 4. Кипнис С.Л., Быкова Г.Ф. Глюкокортикоидная гистологические признаки, которые можно функция надпочечников и состояние симпатико-адре трактовать как начинающуюся атрофизацию наловой системы у новорождённых с гипоксическим мозгового вещества надпочечника повреждением центральной нервной системы // Невро 3. В дальнейшем необходимо осуществить патология. - 1976. - №10. - С. 1503-1507. патологоанатомическое исследование надпо- 5. Крючков А.Н. Апоптоз: общебиологический принцип типологии. Материалы 5-й Межрегиональной чечников умерших плодов и новорождённых научно-практической конференции патологоанато детей в связи с перенесённой острой асфик мов Урала и Западной Сибири. - Челябинск, 2001. - сией, а также функциональное исследование С. 526-529. надпочечников (то есть определение концен-6. Сепетлиев Д. Статистические методы в научных медицинских исследованиях. - М.: Медицина, 1968. - трации гормонов надпочечников в пуповин С. 419. ной крови) для определения особенностей у 7. Adamu A.N., Ekele B.A., Ahmed Y. et al. Pregnancy выздоровевших и умерших детей. outcome in women with eclampsia at a tertiary centre in 4. Результаты исследования обосновывают northern Nigeria // Afr. J. Med. Med. Sci. - 2012. - Vol. 41, необходимость клинических исследований, N 2. - P. 211-219. 8. Guenther M.A., Bruder E.D., Raff H. Effects of посвящённых коррекции функций надпо body temperature maintenance on glucose, insulin, and чечников у новорождённых, перенёсших со corticosterone responses to acute hypoxia in the neonatal стояние острой гипоксии интранатально и rat // Am. J. Physiol. - Regul., Integrat., Comparat. постнатально, а также изучению последствий Physiol. - 2012. - Vol. 302, N 5. - P. 627-633. 9. Harris T.A., Healy G.N., Colditz P.B. Associations для морфофункционального состояния над between serum cortisol, cardiovascular function and почечников в таких случаях во внеутробной neurological outcome following acute global hypoxia in the жизни.

About the authors

G I Gubina-Vakulik

Kharkiv National Medical University, Kharkiv, Ukraine

A V Andreev

Kharkiv National Medical University, Kharkiv, Ukraine

Email: reklama-kharkov@ukr.net

N G Kolousova

Kharkiv National Medical University, Kharkiv, Ukraine

References

Supplementary files