Цитоморфологическая характеристика и цитокиновый профиль индуцированной мокроты и назального секрета у детей с внебольничной пневмонией и острым бронхитом

Полный текст

Болезни органов дыхания стабильно занимают первое место в структуре общей заболеваемости детей и подростков [1, 2, 7, 8, 11]. Современная особенность пневмоний и бронхитов - склонность к вялому, затяжному течению с маловыраженной температурной реакцией, порой скудными физикальными изменениями [2]. Одной из причин может быть изменение местной иммунологической защиты респираторного тракта. Возможности оценки мукозальной защиты расширились благодаря появлению нового доступного для детской практики метода получения индуцированной мокроты (ИМ) [9, 10]. Цель работы - охарактеризовать механизмы неспецифического воспаления дыхательных путей по параметрам ИМ и назального секрета при внебольничной пневмонии и остром бронхите у детей. Обследованы 100 детей в возрасте от 7 до 16 лет с острой бронхолёгочной патологией, находившихся на лечении в детском стационаре городской клинической больницы №18 г. Казани. Получение информированного согласия, сбор анамнеза, предварительное обследование и забор биологического материала проводили в соответствии с разрешением Республиканского комитета по этическим вопросам Министерства здравоохранения Республики Татарстан. Пациенты были разделены на две группы: первую составили 49 детей с внебольничной пневмонией (ВП), вторую - 51 ребёнок с острым бронхитом (ОБ). По результатам рентгенографии органов грудной клетки у 32 (65,3%) детей с ВП был выявлен очаговый вариант воспалительного поражения лёгких, а у 17 (34,7%) пациентов - очагово-сливной. Контрольная группа была сформирована из 25 практически здоровых детей, сопоставимых с больными по возрасту и полу. В момент поступления в стационар в клинической картине больных очаговой и очагово-сливной формой ВП присутствовали респираторный синдром, признаки дыхательной недостаточности I-II степени, синдром интоксикации. Выраженная воспалительная активность крови отмечена в 30 (61,2%) случаях ВП. У 19 (38,8%) детей этой группы воспалительный процесс в лёгких протекал на фоне ареактивных показателей, что указывало на гипорезистентное состояние организма. ОБ протекал более благоприятно. Состояние больных при поступлении было средней тяжести, среди жалоб преобладали кашель и субфебрильная температура тела. Физикально при аускультации в лёгких на фоне жёсткого дыхания регистрировали наличие сухих и влажных крупно- и среднепузырчатых хрипов. Обследование и терапию больных проводили в соответствии с республиканскими медико-экономическими стандартами. Лабораторные исследования включали анализ параклинических параметров и специальные методы. Концентрацию цитокинов определяли в назальном секрете и ИМ. Назальный секрет получали по методике Л.В. Ковальчука и соавт. в собственной модификации [3]. Полоски фильтровальной бумаги размером 10×3 мм в количестве двух штук помещали пинцетом в нижний носовой ход на 3-5 мин. После извлечения полосок проводили элюцию назального секрета в 100 мкл изотонического раствора натрия хлорида. ИМ получали по общепринятой методике с применением ультразвукового небулайзера (OMRON NE-U-17, Япония) [4]. Обработка ИМ включала инкубацию с 1% раствором трипсина в термостате при 37 °С, механическую гомогенизацию, центрифугирование (3000 об/мин, 10 мин) и отмывание с помощью раствора Хенкса. Супернатант применяли для определения цитокинов, а из полученного осадка готовили два-три мазка. Препараты высушивали и окрашивали по Паппенгейму-Крюкову. Качество полученной ИМ и её пригодность для дальнейшего исследования оценивали по методу Barlett [5]. При удовлетворительном результате с помощью 100-кратного увеличения объектива микроскопа под иммерсией просматривали 20-30 полей с подсчётом не менее 400 клеток. Учитывали нейтрофилы, альвеолярные макрофаги, лимфоциты, эозинофилы и эпителиальные клетки. Полученные результаты выражали в процентах. Процессы деструкции в нейтрофилах и эпителиальных клетках определяли по методу Л.А. Матвеевой, в основе которого лежит выделение пяти классов деструкции в зависимости от изменений структурной целостности клеточных элементов [6]. Далее рассчитывали индекс деструкции клеток (ИДК), средний показатель деструкции (СПД) и индекс цитолиза клеток (ИЦК). ИДК ; СПД ; ИЦК , где 0, 1, 2, 3, 4 - номера классов деструкции (0 - нормальная структура, 4 - полная деструкция с распадом); n0, n1, n2, n3, n4 - количество клеток соответствующего класса. Определение цитокинов в назальном секрете и ИМ проводили методом иммуноферментного анализа с использованием стандартных коммерческих наборов реактивов «ИЛ-8-ИФА-БЕСТ», «ИЛ-10-ИФА-БЕСТ», «ИЛ-17-ИФА-БЕСТ», «Альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-бест», Новосибирск). Для статистической обработки полученных данных использовали программу «Биостатистика 4.03» для Windows. Нормальность распределения признака определяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Описательный анализ включал определение среднего арифметического значения, ошибки среднего значения, а также расчёт минимального и максимального значений для ненормально и несимметрично распределённых параметров. Сравнительный анализ основывался на определении достоверности разницы показателей по t-критерию Стьюдента для параметрических и по Z-критерию Манна-Уитни для непараметрических показателей. Критический уровень статистической значимости (р) при проверке статистических гипотез в исследовании принимали равным 0,05. Степень взаимосвязи между признаками оценивали, вычисляя коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R). Анализ клеточного состава ИМ выявил достоверные различия между пациентами с бронхолёгочной патологией и контрольной группой (табл. 1). При ВП отмечено увеличение количества нейтрофилов, лимфоцитов, тогда как при ОБ данные показатели не отличались от контрольной группы. При этом состав клеточных элементов в ИМ значительно варьировал в зависимости от морфологической формы воспалительного процесса в лёгких. Так, при очагово-сливной форме количество нейтрофилов было выше, чем при очаговой (61,3±2,4%) и достигало 64,1±1,2% (р <0,05). Количество альвеолярных макрофагов в ИМ при ВП составляло 24,3±0,8%, что в 2,6 раза меньше, чем при ОБ (63,3±0,6%) и в контрольной группе (70,8±0,8%) (табл. 2). Кроме того, у пациентов с ОБ отмечено повышение количества эпителиальных клеток в ИМ до 10,7±0,3% (против 3,5±0,2% при ВП). У детей контрольной группы основная популяция нейтрофилов и эпителиальных клеток была представлена морфологически целыми клетками (см. табл. 2). При ВП и ОБ в ИМ пациентов регистрировали снижение количества неповреждённых клеток. Наибольшее количество повреждённых нейтрофилов отмечали при ВП: 2-ю степень деструкции выявляли в 1,5 раза чаще, чем при ОБ; 3-ю - в 1,7 раза; 4-ю степень (полный распад клеток) - в 4 раза чаще (р <0,001). Наиболее выраженные деструктивные процессы в нейтрофилах выявляли при очагово-сливной форме ВП. У больных ОБ, напротив, количество морфологически целых нейтрофилов (0-я степень деструкции) почти в 2 раза превышало значение аналогичного показателя при ВП, превалировали деструктивно изменённые эпителиальные клетки. Известно, что миграция нейтрофилов в очаг поражения контролируется хемокинами, в частности провоспалительным интерлейкином-8 (ИЛ-8). Как при ВП, так и при ОБ содержание ИЛ-8 было достоверно увеличено по сравнению с контрольной группой (табл. 3). Более выраженное повышение концентрации ИЛ-8 в назальном секрете и ИМ отмечено при ВП (112,7±2,3 и 236,2±5,5 пг/мл соответственно) в сравнении с ОБ, при котором эти значения достигали 98,5±2,2 и 177±4,7 пг/мл соответственно (р <0,001). Уровень ИЛ-8 в ИМ был максимальным при очагово-сливной форме (256,1±5,0 пг/мл), тогда как в назальном секрете при ВП выявлена лишь тенденция к возрастанию содержания этого цитокина. Выявлено статистически значимое увеличение синтеза провоспалительного цитокина ИЛ-17 в ИМ при острой бронхолёгочной патологии, причём максимальный его уровень регистрировали при ВП (см. табл. 3). При ВП содержание фактора некроза опухоли альфа в назальном секрете и ИМ существенно отличалось от контрольных величин, тогда как при ОБ показатели были идентичны контрольной группе (см. табл. 3). Обобщая вышеприведённые данные, можно говорить о том, что локальный синтез провоспалительных цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-17 и фактора некроза опухоли альфа) на уровне верхних и нижних дыхательных путей характеризуется существенным увеличением их концентраций при ВП, особенно при очагово-сливной форме. Примечательно, что содержание противовоспалительного ИЛ-10 в назальном секрете как при ВП, так и при ОБ не отличалось от контрольных значений. Более того, при ВП в ИМ его количество снижалось и даже имело более низкие значения, чем у больных ОБ (см. табл. 3). У больных ВП установлена тесная прямая корреляция между уровнем провоспалительного цитокина ИЛ-8 в ИМ и количеством нейтрофилов с 3-й степенью деструкции (r=0,26; р=0,05), эпителиальных клеток с 4-й степенью деструкции (r=0,28; р=0,05), между уровнем ИЛ-10 и числом морфологически целых нейтрофилов (r=0,22; р=0,028), а также эпителиальных клеток (r=0,36; р=0,01), и обратная связь между содержанием фактора некроза опухоли альфа и количеством нейтрофилов с 0-й степенью деструкции (r=-0,32; р=0,023). Выявленный дисбаланс содержания про- и противовоспалительных цитокинов, ярко выраженный при ВП, можно рассматривать, как существенный фактор повреждения клеток и тканей. ВЫВОДЫ 1. В индуцированной мокроте больных внебольничной пневмонией, особенно очагово-сливного характера, происходит увеличение содержания провоспалительных цитокинов (интерлейкинов-8 и -17, фактора некроза опухоли альфа) с одновременным снижением количества противовоспалительного интерлейкина-10. 2. Установлены выраженные деструктивные изменения нейтрофилов в индуцированной мокроте при очагово-сливном характере внебольничной пневмонии. 3. Индуцированная мокрота позволяет получить ценную информацию о степени активности воспалительного процесса в дыхательных путях, что может быть использовано в педиатрической практике с целью своевременной диагностики и рациональной терапии. Таблица 1 Клеточный состав индуцированной мокроты у детей, больных внебольничной пневмонией (ВП) и острым бронхитом (ОБ), % (М±m) Группа Нейтрофилы Эпителий Макрофаги Лимфоциты Эозинофилы ОБ (n=51) 20,6±0,4 10,6±0,2* 63,3±0,5 4,3±0,1 1,01±0,05 ВП (n=49) 64,7±0,8*# 3,5±0,1# 24,3±0,8*# 6,4±0,3*# 0,9±0,07 Контрольная (n=25) 20,1±0,8 3,5±0,1 70,8±0,8 4,6±0,6 0,9±0,08 Примечание: *р <0,05 по сравнению с контрольной группой; #р <0,05 по сравнению с группой больных ОБ. © 50. «Казанский мед. ж.», №5. Таблица 2 Цитоморфологические показатели (ЦП) нейтрофилов и эпителиальных клеток индуцированной мокроты у детей, больных внебольничной пневмонией (ВП) и острым бронхитом (ОБ) (М±m) Группа детей ЦП нейтрофилов ЦП эпителиальных клеток Класс деструкции, % Индексы деструкции Класс деструкции, % Индексы деструкции 0 1 2 3 4 ИДК СПД ИЦК 0 1 2 3 4 ИДК СПД ИЦК ОБ (n=51) 47,2± 0,06* 22,1± 0,7* 16,4± 0,2* 11,09± 0,1* 3,09± 0,1* 1,5± 0,9* 1± 0,009* 0,03± 0,001* 31,9± 0,3* 33,04±0,4* 20,8± 12* 12± 0,09* 2,1± 0,09* 0,7± 0,003* 1,2± 0,007* 0,02± 0,001* ВП (n=49) 21,7± 0,7*# 18,2± 0,7*# 25,6± 0,3*# 20,9± 0,5*# 13,3± 0,3*# 0,7± 0,007*# 1,8± 0,02*# 0,1± 0,003*# 62,6± 0,6*# 14,2± 0,5*# 14,6± 0,2*# 7,3± 0,1*# 1± 0,06*# 0,3± 0,007*# 0,7± 0,008*# 0,01± 0,0006*# Контрольная (n=25) 77,3± 0,9 16,5± 0,9 6,1± 0,1 0 0 0,2± 0,009 0,2± 0,009 0 86,7± 0,9 6,5± 0,2 6,7± 0,7 0 0 0,1± 0,009 0,2± 0,01 0 Примечание: *р <0,05 по сравнению с контрольной группой; #р <0,05 по сравнению с группой больных ОБ; ИДК - индекс деструкции клеток; СПД - средний показатель деструкции; ИЦК - индекс цитолиза клеток. Таблица 3 Содержание цитокинов (пг/мл) в назальном секрете (НС) и индуцированной мокроте (ИМ) детей, больных внебольничной пневмонией (ВП) и острым бронхитом (ОБ) (М±m) Нозологические формы ИЛ-10 ИЛ-8 ИЛ-17 ФНОα НС ИМ НС ИМ НС ИМ НС ИМ ВП (n=49) 1,7±0,07 0,6±0,041,2 112,7±2,31,2 236,2±5,51,2 1,3±0,1 19,6±1,071,2 2,5±0,11,2 3,5±0,11,2 Очаговая форма ВП (n=32) 1,8±0,08 0,6±0,04 110,9±2,6 206,6±6,5 1,3±0,1 19,5±1 2,6±0,1 2,7±0,1 Очагово-сливная форма ВП (n=17) 1,5±0,1 0,4±0,033 116,2±4,4 256,1±5,03 1,2±0,1 19,9±1,5 2,4±0,2 4±0,23 ОБ (n=51) 1,6±0,1 0,8±0,051 98,5±2,21 177±4,71 0,9±0,05 8,1±0,21 1,4±0,07 1,5±0,07 Контрольная группа (n=25) 1,6±0,04 1,7±0,04 26,9±0,7 16,4±0,5 1,1±0,05 1,5±0,04 1,5±0,04 1,6±0,03 Примечание: ИЛ - интерлейкин; ФНОα - фактор некроза опухоли альфа; 1р <0,05 между группами больных и контрольной группой; 2р <0,05 между группами больных ОБ и ВП; 3р <0,05 между группами больных с очаговой и очагово-сливной формами внебольничной пневмонии.

Об авторах

Лилия Фаридовна Галимова

Казанский государственный медицинский университет

Email: lilu1@inbox.ru

Ольга Ивановна Пикуза

Казанский государственный медицинский университет

Елена Валентиновна Агафонова

Казанский государственный медицинский университет

Список литературы

Дополнительные файлы