The level of inhibin A in the blood serum of women suffering from chronic trichomoniasis as a predictor of infertility

Full Text

Ингибин А — белок, выделяемый зернистыми клетками яичников и влияющий на секрецию фолликулостимулирующего гормона. Ингибин А содержится в плазме крови, а также в большом количестве — в фолликулярной жидкости. Его основная функция — подавление секреции гипофизом фоллитропина путём воздействия на гипоталамус по принципу обратной связи. Молекулярный вес «развитой» формы ингибина А составляет 32 000 Да. Ингибин А состоит из одной α-цепочки (~18 кДа) и одной β-цепочки (~14 кДа), которые соединены дисульфидными мостиками. Ингибин А относится к группе внутриклеточных сигнальных Smad-белков [1, 2].

Концентрация сывороточного ингибина А у женщин в норме во время менструального цикла повышается от 15,1±2,6 пг/мл в ранней фолликулярной фазе до 69,2±11,3 пг/мл в средней лютеиновой фазе. Содержание ингибина А в фолликулярной жидкости составляет 488 нг/мл. У женщин после менопаузы уровень ингибина А снижается и составляет менее 2 пг/мл [3].

Ингибин А играет существенную роль в течении беременности. Исследования показали, что жёлтое тело яичника (или фетоплацентарная единица) служит главным поставщиком ингибина А. Известно, что уровень этой субстанции в крови пациенток отражает количество и качество антральных фолликулов, что определяет овариальный резерв. Возрастное снижение плодовитости, связано, прежде всего, с уменьшением овариального резерва и качества овоцита, однако и молодые пациентки могут иметь сниженный овариальный резерв как осложнение после перенесённых воспалительных заболеваний или инфекций, передающихся половым путём [4–6].

В то же время, как полагают ряд учёных, наличие у пациенток воспалительного процесса, сопровождающегося появлением в сыворотке крови биохимических факторов воспаления, может снижать уровень ингибина А. К ним следует отнести, прежде всего, цитокины и острофазовые белки. Выяснение причин снижения уровня и активности ингибина А у женщин, страдающих воспалительными заболеваниями репродуктивной системы и, в том числе, инфекционными заболеваниями, поможет не только повысить качество диагностики, но и выявит новые возможности в разработке методов лечения женского бесплодия [7, 8].

Целью исследования было определение взаимосвязи уровня ингибина А и биохимических факторов воспаления с развитием бесплодия у женщин, страдающих хроническим трихомонозом.

Объектом исследования служила сыворотка крови 167 женщин в возрасте 22–29 лет (средний возраст 24,1±3,45 года), находившихся на амбулаторном лечении в женской консультации городской поликлиники №8 г. Астрахани с 2012 по 2018 гг. и страдающих хроническим трихомонозом (согласно Международной классификации болезней 10-го пересмотра: «Хроническая инфекция — длительность инфекции более 2 мес»).

Критериями включения пациенток в исследование были возраст и наличие диагноза «Хронический трихомоноз». Для подтверждения диагноза использовали метод бактериального посева на питательные среды, который проводили в централизованной лаборатории Астраханского областного кожно-венерологического диспансера.

В качестве контроля была использована сыворотка крови 22 практически здоровых фертильных женщин 22–29 лет, проходивших ежегодный профилактический осмотр (средний возраст 25,0±1,21 года), не страдающих трихомонозом и не имевших заболеваний, передающихся половым путём. Сравнение групп по полу и возрасту не выявило статистически значимых различий (p >0,05).

Исследование одобрено локальным этическим комитетом городской поликлиники №8 г. Астрахани (протокол №15 от 21.11.2012).

У всех обследованных на 3–5-й день менструального цикла методом иммуноферментного анализа определяли сывороточный уровень ингибина А в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения [8].

Забор крови осуществляли из локтевой вены утром, строго натощак, после чего её центрифугировали в режиме 3000 об./мин в течение 10 мин, затем консервировали 1% раствором азида натрия.

Определение фенотипа лимфоцитов осуществляли окрашиванием их моноклональными антителами (производство ГНЦ «Институт иммунологии МЗ России», Москва) с последующим использованием люминесцентного микроскопа.

Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови оценивали стандартным методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием моноспецифических антисывороток (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва). Содержание иммуноглобулинов выражали в мг/%.

Цитокины определяли путём исследования спонтанного синтеза интерлейкинов (ИЛ) — ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-10, а также интерферона γ (ИФНγ). Лимфоидные клетки предварительно инкубировали в течение 24 ч, после чего методом иммуноферментного анализа определяли концентрацию данных цитокинов. Для определения содержания ИЛ-1β и ИЛ-8 использовали тест-системы компании «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург, Россия); ИЛ-10 и ИФНγ — Immunotech (Франция).

Концентрацию лактоферрина определяли иммуноферментным методом с помощью тест-систем производства ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург, Россия). Концентрации α2-макроглобулина и С-реактивного белка (СРБ) определяли нефелометрическим методом. Концентрацию фибриногена оценивали коагулогическим методом.

Концентрация ингибина А в сыворотке крови контрольной группы на 3–5-й день менструального цикла составляла 15,2±2,4 пг/мл (10,8–19,2 пг/мл). В группе больных трихомонозом отмечена высокая вариабельность результатов — от 4,3 до 29,4 пг/мл, поэтому больные были разделены на две группы — с низким и нормальным уровнем ингибина А.

В группу с нормальной концентрацией ингибина А вошли 129 пациенток. Содержание ингибина А варьировало от 10,4 до 29,4 пг/мл, в среднем по группе составляло 16,2±2,4 пг/мл. Группы сравнительного анализа были сопоставимы по полу, возрасту и наличию диагноза «Трихомоноз».

Во вторую группу вошли 38 пациенток (22,8% общего числа обследованных больных). Концентрация ингибина А у них в крови колебалась от 5,3 до 9,1 пг/мл, среднее значение составило 8,23±0,81 пг/мл.

Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью программы IBM SPSS Statistics v. 21 (IBM Corp., Armonk, NY, США). Для каждой выборки вычисляли показатели описательной статистики: количество наблюдений в исходной выборке (n), среднее арифметическое полученных значений (М), среднее квадратическое отклонение (m), стандартную ошибку среднего арифметического, минимальное (min) и максимальное (max) значения изучаемого признака, а также показатели относительных величин (%) и их ошибки. Вид распределения количественных данных анализировали с помощью критерия Шапиро–Уилка. После оценки соответствия нормальному закону распределения выбирали метод статистического анализа (параметрический или непараметрический). При нормальном распределении количественных переменных центральные тенденции и рассеяния признаков описаны с помощью среднего значения (М) и среднего квадратического отклонения (m). При распределении количественных признаков, отличном от нормального, описание проводили с помощью медианы (Me) и 25–75% интерквартильного размаха (LQ; UQ). Доверительные интервалы рассчитывали для вероятности р=95%. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р <0,05.

Для расчёта статистической значимости различий в двух связанных группах использовали t-критерий Стьюдента, в двух несвязанных группах — t-критерий Стьюдента или непараметрический критерий Манна–Уитни.

Для устранения возникновения проблемы множественных сравнений выполняли однофакторный дисперсионный анализ в сравнении со стандартным значением критерия Фишера (F) с использованием рангового анализа вариаций по Краскелу–Уоллису. При р <0,05 принимали альтернативную гипотезу о различии групп и проводили парное сравнение групп с помощью критерия Манна–Уитни.

Анализ историй болезни показал, что в первой группе больных с нормальным уровнем ингибина А в ходе заболевания вторичное бесплодие развилось в 23,3% случаев (34 женщины). У 30 пациенток оно сопровождалось снижением овариального запаса, симптомами которого были нарушения менструальной функции, ановуляция и невынашиваемость беременности. У 4 пациенток развилось бесплодие, связанное с трубными и перитонеальными факторами.

В группе пациенток со сниженным уровнем ингибина А в течение заболевания у 24 женщин развилось вторичное бесплодие, что составляло 63,20% общего числа обследованных. Бесплодие у женщин этой группы также было связано со снижением овариального запаса. У 2 женщин развилось бесплодие, связанное с трубными и перитонеальными факторами.

Полученные данные об уровне маркёров воспаления в сыворотке крови женщин, страдающих хроническим трихомонозом, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Уровни маркёров воспаления в крови женщин, страдающих хроническим трихомонозом

Маркёры воспаления	Группы обследованных		p
	Контрольная группа (n=22)	Больные трихомонозом (n=167)
Интерлейкин-1β	103,6±8,4	292,5±12,1	0,00081
Интерлейкин-8, пг/мл	19,8±2,5	10,9±2,1	0,00092
Интерферон γ	25,1±1,6	8,3±1,1	0,00041
Интерлейкин-10, пг/мл	178,3±41,5	1565,0±123,0	0,00024
Иммуноглобулин А, мг%	143,0±11,2	203,0±19,0	0,040
Иммуноглобулин М, мг%	122,0±9,30	137,1±12,0	0,052
С-реактивный белок, мкг/мл	0,30±0,01	19,5±0,80	0,000011
Лактоферрин, нг/мл	445,1±104,0	3475,0±178,1	0,00079
α2-Макроглобулин, мкг/мл	190,0±18,1	187,0±24,2	0,97
Фибриноген, мг/мл	1,7±0,8	1,6±0,95	0,90

 

Для описания функционального состояния Т-хелперов (Тh1 и Тh2) у пациенток определили содержание ИФНγ, ИЛ-8 и ИЛ-1β.

В группе контроля концентрация ИЛ-1β мононуклеарами in vitro составила 103,6±8,4 пг/мл и колебалась от 96,0 до 112,0 пг/мл. У пациенток с хроническим трихомонозом показатель спонтанного синтеза ИЛ-1β был существенно выше и составлял 292,5±12,1 пг/мл (p=0,00081).

В группе контроля концентрация ИЛ-8 была 19,8±2,3 пг/мл, в группе больных показатель спонтанного синтеза ИЛ-8 был ниже контрольных значений и составлял только 10,9±2,1 пг/мл (p=0,00092), что позволяет предположить наличие связи между уменьшением синтеза этого цитокина и снижением фагоцитарной активности нейтрофилов.

Концентрация ИФНγ в сыворотке крови контрольной группы составила 25,10±1,60 пг/мл, в то время как у больных спонтанный синтез ИФНγ был почти в 3 раза меньше и составил 8,3±1,1 пг/мл (p=0,00041). Очевидно, что недостаточность синтеза ИФНγ, с одной стороны, отражает нарушение функциональной активности CD4+-клеток у больных, а с другой — может приводить к состоянию толерантности к инфекции.

Спонтанный синтез ИЛ-10 в группе контроля составлял от 116,0 до 250,0 пг/мл (в среднем 178,3±41,5 пг/мл), в то время как у больных он повышался до 1565,0±123,0 пг/мл, то есть более чем в 8 раз (p=0,00024).

Содержание иммуноглобулинов A и M у больных в целом соответствовало контрольным значениям, хотя у двух третей пациенток выявлено изменение их соотношения (повышение уровня иммуноглобулина A и/или снижение иммуноглобулина М).

Таким образом, результаты исследования цитокинового профиля у женщин с хроническим трихомонозом вполне убедительно демонстрируют преобладание формирования иммунного ответа по типу Th2.

Известно, что цитокины инициируют синтез гепатоцитами вторичных медиаторов воспаления — белков острой фазы. Содержание СРБ в сыворотке крови контрольной группы составило 0,3±0,01 мкг/мл. У больных выявлено возрастание его уровня более чем в 65 раз — до 19,5±0,8 мкг/мл (p=0,000011), однако это значительно ниже, чем при большинстве бактериальных инфекций, и более характерно для хронических вирусных заболеваний [9, 10].

Уровень лактоферрина в крови контрольной группы составил 445,0±104,0 нг/мл. В группе больных его концентрация превышена почти в 8 раз — до 3475,0±178,0 нг/мл (p=0,00079). Такие значения гораздо чаще отмечают при острых инфекциях, в том числе и заболеваниях, передающихся половым путём, они совсем не типичны для большинства хронических бактериальных инфекций [11, 12].

В последующем был проведён ретроспективный анализ вариационных рядов, при котором полученные результаты группировали вне зависимости от концентрации ингибина А и изучаемых факторов воспаления, в их взаимосвязи с состоянием репродуктивной функции женщин, страдающих трихомонозом.

Как уже было упомянуто выше, у 30 больных с нормальным уровнем ингибина А отмечено развитие бесплодия, у остальных фертильность сохранена или о её нарушениях нет достоверных данных. Анализ показал, что концентрация только двух маркёров воспаления в крови женщин, страдающих трихомонозом (СРБ и лактоферрина), имеет различия между женщинами с нарушениями фертильности и без её нарушения. Естественно предположить, что эти маркёры воспаления в определённой степени связаны с развитием нарушений репродуктивной функции у женщин, страдающих трихомонозом.

Мы допускаем возможность образования в сыворотке крови пациенток комплексов ингибин А-лактоферрин, которые могут снижать биологическую активность ингибина А. Это реализуется, как минимум, двумя механизмами. Во-первых, это может быть результатом электростатического взаимодействия нескольких молекул ингибина А, несущих достаточно высокий отрицательный заряд, с поликатионом лактоферрином. Во-вторых, возможен механизм преимущественно гидрофобного взаимодействия молекул лактоферрина и ингибина А.

Влияние СРБ на активность ингибина А вряд ли можно также объяснить образованием комплексов. Вероятнее всего, оно носит системный характер и обусловлено влиянием высоких концентраций СРБ на функционирование ингибина А на уровне целостного организма. В частности, возможно влияние СРБ на синтез ИЛ-1β в фолликулах яичников, так как этот цитокин синтезируется гранулёзой, и его высокая концентрация в фолликулярной жидкости коррелирует со степенью зрелости и частотой оплодотворения овоцита. С другой стороны, ИЛ-1β — провоспалительный цитокин, играющий существенную роль в развитии воспалительной реакции, поскольку способен индуцировать бо́льшую часть местных и общих её проявлений. Известно также, что высокие концентрации СРБ (10 мкг/мл и выше) способны ингибировать синтез ИЛ-1β наряду с простагландином Е2 и глюкокортикоидами.

Итак, в группе больных хроническим трихомонозом обнаружена существенная вариабельность концентрации ингибина А (4,3–29,4 нг/л). В группе больных, имевших сниженные уровни ингибина А, в 63,2% случаев диагностировано в последующем развитие вторичного бесплодия, в то время как в группе больных, имевших нормальное содержание ингибина А, вторичное бесплодие развилось только в 12,9% случаев (р=0,00023). Установлено, что из всех белков острой фазы только уровни СРБ и лактоферрина имеют прогностическое значение и статистически значимо (р=0,0005 и р=0,0009 соответственно) различаются между группой больных с развившимся впоследствии бесплодием и группой пациенток без развившегося бесплодия.

Вывод

Из всех белков острой фазы только уровни С-реактивного белка и лактоферрина имеют прогностическое значение и статистически значимо различаются в группах женщин с развившимся впоследствии бесплодием и не осложнённым бесплодием трихомонозом.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

N I Gudinskaya

Astrakhan State Medical University

Email: oboyko08@mail.ru
SPIN-code: 5906-5854
Russian Federation, Astrakhan, Russia

O V Boyko

Astrakhan State Medical University

Author for correspondence.
Email: oboyko08@mail.ru
SPIN-code: 3043-7974
Russian Federation, Astrakhan, Russia

N A Gribova

Clinical Maternity Hospital

Email: oboyko08@mail.ru
Russian Federation, Astrakhan, Russia

R I Mukhamedzyanova

Astrakhan State Medical University

Email: oboyko08@mail.ru
Russian Federation, Astrakhan, Russia

References

Supplementary files