Определение фелодипина в биологических жидкостях
- Авторы: Квачахия Л.Л.1, Шорманов В.К.1, Кононенко Н.С.1
-
Учреждения:
- Курский государственный медицинский университет
- Выпуск: Том 100, № 4 (2019)
- Страницы: 650-656
- Тип: Экспериментальная медицина
- Статья получена: 31.07.2019
- Статья одобрена: 31.07.2019
- Статья опубликована: 31.07.2019
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/15550
- DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2019-650
- ID: 15550
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель. Разработка методик определения фелодипина в крови и плазме крови.
Методы. Объект исследования — фелодипин [3-этил-5-метил-4-(2,3-дихлорофенил)-2,6-диметил-1,4-дигидропиридина-3,5-дикарбоксилат]. Эксперименты проводили на модельных смесях фелодипина с кровью и плазмой крови человека. В качестве изолирующего агента для извлечения фелодипина из биологических жидкостей предложен ацетон. Для идентификации и количественного определения фелодипина в извлечениях из крови и плазмы крови предложены методы тонкослойной хроматографии, спектрофотометрии и газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией.
Результаты. Показана возможность применения ацетона в качестве изолирующего агента для извлечения фелодипина из биологических жидкостей. Установлено, что оптимальные условия извлечения фелодипина ацетоном достигаются уже при 2-кратном настаивании биологического объекта с изолирующим агентом, если массовое соотношение изолирующей жидкости и биологического материала на каждом этапе настаивания составляет не менее 2:1, а продолжительность настаивания — минимум 30 мин. Оптимальные условия очистки фелодипина достигались в макроколонке (15×1 см) сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм при элюировании вещества полярным элюентом ацетонитрил-вода (7:3). Разработаны методики определения фелодипина в крови и плазме крови. При содержании фелодипина в количестве 25 мг в 25 г биологической жидкости разработанные методики позволяют определять в крови 86,01–87,86%, в плазме крови 95,64–96,18% данного вещества. Значения предела обнаружения фелодипина в крови и плазме крови разработанными методиками составляют 200 мкг/100 г и 150 мкг/100 г соответственно.
Вывод. Разработаны методики определения фелодипина в биологических жидкостях на основе изолирования ацетоном и очистки в колонке сорбента «Силасорб С-18»; используя данные методики, удаётся определить до 87,86% аналита в крови и до 96,18% в плазме крови.
Ключевые слова
Полный текст
Фелодипин [3-этил-5-метил-4-(2,3-дихлорофенил)-2,6-диметил-1,4-дигидропири-дина-3,5-дикарбоксилат (IUPAC); другие названия: 3-этил-5-метил-4-(2,3-дихлорофенил-l)-2,6-диметил-1,4-дигидро-3,5-пиридин-дикарбоксилат, (±)-этилметил-4-(2,3-дихлорофенил)-1,4-дигидро-2,6-диметил-3,5-пиридиндикарбоксилат, 4-(2,3-дихлорфенил)-1,4-дигидро-2,6-диметил-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты этилметиловый эфир] — один из представителей группы дигидропиридиновых блокаторов кальциевых каналов II поколения, к которой также относятся нифедипин, амлодипин и исрадипин. Фелодипин применяют в лечебной практике для лечения артериальной гипертензии [1, 2].
В основе действия рассматриваемого соединения лежит блокада притока ионов кальция в гладкие мышцы сосудов и клетки сердечной мышцы во время деполяризации [1, 3].
Фелодипин представляет собой светло-жёлтый кристаллический порошок с температурой плавления 142–145 °C [2], нерастворимый в воде (19,7 мг/л), хорошо растворимый в дихлорметане и этаноле. Определена возможность растворения данного аналита в жидком и сверхкритическом диоксиде углерода при различных температуре и давлении [3, 4]. log P (октанол-вода) фелодипина 3,86 [3]. рКа фелодипина, определённое спектрофотометрическим методом, составляет 5,07 [5].
Фелодипин и ряд других блокаторов кальциевых каналов токсичны для теплокровных и могут стать причиной отравлений различной степени тяжести [6]. Описан ряд летальных отравлений людей фелодипином [6–8].
Его полулетальная доза (мг/кг) для мышей при пероральном введении — 250, при внутривенном — 3,1, при внутрибрюшинном — 76, при подкожном — 205; для крыс при пероральном введении — 1050, при внутривенном — 5,4, при внутрибрюшинном — 23, при подкожном — ˃600; для собак при пероральном введении — 200 [3].
В качестве основного метаболита фелодипина называют дегидрофелодипин. Изолирование фелодипина из плазмы крови человека можно проводить смесью диэтиловый эфир-гексан (1:1 по объёму). Определение данного вещества в извлечении осуществляют методом жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией, используя колонку Hypersil BOS-C18 (150 мм×2,1 мм, 5 мкм), элюент ацетонитрил-0,1% муравьиной кислоты (12:88 по объёму) и принцип распылительной ионизации [9].
Для определения фелодипина в плазме крови человека применяют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в колонке с привитой фазой С-18 при элюировании мицеллярной подвижной фазой (значение отрицательного логарифма концентрации водородных ионов 7), состоящей из 85 мМ додецилсульфата натрия, 25 мМ фосфатного буфера и 6,5% пентанола при флюориметрическом детектировании [10].
Описана возможность извлечения фелодипина из плазмы крови человека смесью диэтилового эфира и гексана (80:20 по объёму) для дальнейшего определения аналита методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией [11].
Известна методика выделения рассматриваемого соединения из плазмы крови собаки путём обработки биожидкости метанолом, очистки на предколонке и последующего определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией в колонке ZORBAX SB-C18 [12].
В качестве изолирующих агентов для извлечения блокаторов кальциевых каналов, производных 1,4-дигидропиридина, к которым относится и фелодипин, из крови и тканей трупных органов описаны хлороформ и ацетон [13].
Недостаточно высокая степень извлечения фелодипина из биологического материала и очистки от соэкстрактивных веществ биологических матриц характеризует универсальный метод пробоподготовки QuEChERS [14].
Активное применение фелодипина в отечественной и зарубежной медицине, наличие у него токсических свойств, летальные исходы при отравлениях этим соединением определяют его важное судебно-химическое значение.
Вопросы идентификации и количественного определения фелодипина в биологических жидкостях разработаны недостаточно.
Цель исследования — разработка методик определения фелодипина в крови и плазме крови.
Как объект исследования рассмотрен фелодипин [3-этил-5-метил-4-(2,3-дихлорофенил)-2,6-диметил-1,4-дигидропиридина-3,5-дикарбоксилат], соответствующий требованиям фармакопейной статьи предприятия 42-9597-08.
Для извлечения фелодипина из крови и плазмы крови испытывали вариант настаивания с ацетоном, ранее показавшим хорошие результаты изолирования других производных 1,4-дигидропиридина.
Эксперименты проводили на модельных смесях фелодипина с кровью и плазмой крови человека, которые выдерживали полтора часа при 18–22 °C. Исследовали зависимость степени извлечения фелодипина из биологических жидкостей от кратности и продолжительности настаивания с ацетоном, определяли необходимый избыток изолирующего агента по отношению к биологическому объекту [15].
Часть извлечения хроматографировали на пластинах для высокоэффективной тонкослойной хроматографии с подложкой из алюминиевой фольги «Сорбфил» с люминесцентным индикатором фирмы «Имид» (г. Краснодар); элюент — гексан-ацетон (7:3 по объёму). В свете ультрафиолетового облучателя фелодипин обнаруживался в виде тёмного пятна с величиной абсолютной хроматографической подвижности 0,45±0,03. Его извлекали из сорбента гидрофильным элюентом и идентифицировали по характеру электронного спектра элюата. По оптической плотности элюата в области 363 нм (спектрофотометр модели 2000 фирмы «Ленинградское оптико-механическое объединение», г. Санкт-Петербург) определяли количество фелодипина, используя уравнение градуировочного графика.
Извлекаемый фелодипин очищали в макроколонке сорбента с привитой фазой, используя полярный элюент.
В дальнейшем принимали во внимание, что судебно-химическое исследование обязательно включает этап предварительных исследований и этап подтверждающих исследований.
Методом предварительной идентификации служила тонкослойная хроматография (пластины «Сорбфил»). Хроматографировали в цилиндрических стеклянных камерах вместимостью около 600 см3.
Этап подтверждающих исследований включал применение двух физико-химических методов.
Одним из вариантов подтверждающей идентификации служила электронная спектрофотометрия (спектрофотометр модели 2000, растворяющая среда — этанол, волновой диапазон 200–400 нм, толщина поглощающего слоя 1 см). Этот метод использовали и для количественного определения фелодипина.
Для подтверждающей идентификации применяли также метод газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (хроматограф «Agilent Technologies» 6890 Network Gas Chromatography System, США) с масс-селективным детектором 5973 Network (США). Фрагментация молекул проводилась электронным ударом с энергией 70 эВ, сигнал регистрировали по полному ионному току, диапазон сканирования составлял 40–550 m/Z.
Установлена целесообразность изолирования фелодипина из биологического материала ацетоном.
Использование ацетона в качестве изолирующего агента имеет преимущество в том, что с его помощью можно достигать более высокой степени извлечения производных 1,4-дигидропиридина (к которым относится, в частности, фелодипин) из биологических жидкостей по сравнению с употребляемыми изолирующими агентами (хлороформом, дихлорметаном, этилацетатом, эфиром), а также ацетонитрилом (рекомендуемым универсальным методом КВЭЧЕРС).
Проведённые нами эксперименты показали, что особенно заметны преимущества ацетона в сравнении с общеупотребительными изолирующими агентами при извлечении производных 1,4-дигидропиридина из биологических матриц с большим содержанием плотного биологического субстрата, таких как ткани органов трупа и кровь.
Ацетон в отличие от гидрофобных и ряда гидролипофильных экстрагентов в процессе инфузии осаждает бо́льшую часть эндогенных веществ биоматрицы, обеспечивая достаточно простую и эффективную предварительную очистку аналита от соэкстрагирующихся веществ, и не требует, как ацетонитрил, насыщения системы электролитами для достижения уровня очистки, сравнимой с той, которая достигается ацетоном. Преимущества ацетона как изолирующего агента ещё и в том, что он способен разрушать оболочки клеток и способствовать извлечению аналита, находящегося не только в плазме, но и в форменных элементах крови или клетках тканей органов трупа.
К тому же ацетон даёт хорошие результаты изолирования не только из «свежего», но и гнилостно изменённого биологического (трупного) материала, который отличается высокими значениями водородного показателя (рН) среды.
Изолирование аналита сводилось к тому, что некоторое количество крови или плазмы крови настаивали дважды по полчаса с ацетоном, количество которого в 2 раза превышало по массе количество биологической жидкости. Первое и второе извлечения объединяли в чашке для выпаривания, её помещали в ток воздуха с комнатной температурой и испаряли растворяющую среду.
Эффективная очистка фелодипина достигалась в макроколонке (15×1 см) сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм при элюировании вещества смесью ацетонитрил-вода (7:3).
Процесс очистки сводился к тому, что к остатку в выпарительной чашке, полученному после изолирования, приливали 2–2,5 мл смеси ацетонитрил-вода (7:3). Раствор вводили в макроколонку и проводили процесс вымывания (элюирования) фелодипина.
Истекающий из колонки элюат фракциями по 2 мл собирали в отдельные градуированные пробирки. Присутствие фелодипина во фракциях определяли методом тонкослойной хроматографии: пластины «Сорбфил», подвижная фаза гексан-ацетон (7:3), наносимый объём 5–10 мкл, способ детектирования — облучение ультрафиолетовым светом (254 нм).
Обнаружение на хроматограмме пятен с абсолютной хроматографической подвижностью 0,45±0,03 позволяло говорить о присутствии фелодипина в исследованных фракциях элюата.
Группу фракций элюата с 9-й по 11-ю, в которых присутствовал фелодипин, объединяли в выпарительной чашке и удаляли растворитель в токе воздуха комнатной температуры. Остаток растворяли в 5 мл этанола (раствор для анализа).
По 0,5–2,5 мл раствора для анализа вносили в выпарительные чашки №1 и №2, затем испаряли растворитель из чашек в токе воздуха комнатной температуры.
Для идентификации методом тонкослойной хроматографии предложено использование среднеполярной подвижной фазы гексан-ацетон (7:3). Проводя идентификацию, остаток в чашке №1 растворяли в 0,5 мл этанола, количественно переносили этот раствор в виде полосы на линию старта хроматографической пластины. Рядом (в одну точку) наносили 5–10 мкл 0,2% этанольного раствора вещества-стандарта.
После окончания хроматографирования получаемые хроматограммы высушивали и облучали ультрафиолетовым светом (длина волны 254 нм). Фелодипин (пятна тёмного цвета) идентифицировали по величине абсолютной хроматографической подвижности (0,45±0,03).
Для идентификации изолированного вещества методом спектрофотометрии участок хроматограммы с пятном вещества вырезали, помещали в пробирку и элюировали вещество 5 или 10 мл этанола в течение 15 мин при эпизодическом встряхивании пробирки. Светопоглощение элюата исследовали в выбранном диапазоне.
Спектральные кривые аналита, извлечённого из биологических жидкостей и очищенного по предлагаемой схеме, по форме и положению точек экстремумов практически совпадали со спектральной кривой фелодипина-стандарта, что можно увидеть на рис. 1.
Рис. 1. Спектральные кривые фелодипина в этаноле: 1 — 0,0015% раствор стандартного образца; 2 — раствор вещества, изолированного из плазмы крови; 3 — раствор вещества, изолированного из крови
Экспериментально доказано отсутствие фелодипина в контрольных образцах крови и плазмы крови. Величина фонового поглощения элюатов из контрольных хроматограмм в области аналитической длины волны (363 нм) не превышала 0,14 (обусловлено присутствием в 1 мл фотометрируемого раствора эндогенных веществ из 0,5 г биоматрицы). Таким образом, очистка на колонке позволяет значительно уменьшить уровень фона, обусловливаемого присутствием эндогенных веществ биоматрицы в неочищенных извлечениях. В результате этого удаётся значительно снизить значения пределов обнаружения и определения аналита, обеспечив повышение чувствительности определения.
Идентификацию фелодипина методом газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией проводили с использованием колонки DB-1MS [30 м×0,25 мм, толщина слоя неподвижной фазы (диметилполисилоксана) 0,25 мкм]. При проведении определения: температура инжектора составляла 280 °C, интерфейса детектора — 300 °C, начальная температура колонки (80 °C) выдерживалась 2,0 мин, затем увеличивалась со скоростью 40 °C /мин до конечной температуры (250 °C), которую удерживали 6 мин. Подвижной фазой служил гелий, его линейная скорость составляла 0,39 м/с. При идентификации остаток в чашке №2 растворяли в 2 мл дихлорметана и вводили 4 мкл этого раствора в хроматограф без деления потока с задержкой 3 мин.
На рис. 2 и 3 представлены хроматограммы и масс-спектры стандарта фелодипина, а также фелодипина, извлечённого из крови и плазмы крови.
Рис. 2. Хроматограммы (метод газо-жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией) фелодипина: А — стандартного образца; Б — вещества, изолированного из плазмы крови; В — вещества, изолированного из крови
Рис. 3. Масс-спектры фелодипина: А — стандартного образца; Б — вещества, изолированного из плазмы крови; В — вещества, изолированного из крови
Как видно из представленных рисунков, формы пиков на хроматограммах и масс-спектров свидетельствуют в пользу хорошей очистки аналита в рамках задач предлагаемой методики.
Результаты, полученные при идентификации рассматриваемого вещества методом газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией, указывают на то обстоятельство, что значения времени удерживания фелодипина, извлечённого из биологических жидкостей, и фелодипина-стандарта практически совпадали и соответствовали интервалу 9,34–9,58 мин.
На хроматограммах исследуемого соединения в области значений времени удерживания 8,45–10,55 мин не отмечено присутствия (по сравнению с хроматограммой вещества-стандарта) дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии.
В масс-спектрах вещества, извлечённого из биологических жидкостей, присутствовали сигналы характерных для структуры фелодипина положительно заряжённых частиц с массами (m/Z) 42, 67, 106, 150, 178, 210, 238, 280, 310, 338, 354, 383. Среди них основной ион — 238, молекулярный — 338.
По оптической плотности этанольного элюата в области 363 нм определяли количество фелодипина спектрофотометрическим методом.
Разработанные и валидированные методики количественного определения фелодипина в биологических жидкостях (крови и плазме крови) на основе использования спектрофотометрии удовлетворяли критериям линейности, правильности, прецизионности и селективности.
Пределы обнаружения фелодипина в крови и плазме крови составили соответственно 200 мкг/100 г и 150 мкг/100 г, пределы количественного определения — 400 мкг/100 г и 300 мкг/100 г.
Количественная оценка присутствия данного соединения в крови и плазме крови представлена в табл. 1.
Таблица 1. Результаты количественного определения фелодипина в модельных смесях с биологическими объектами
Внесено фелодипина, мг/25 г биологического объекта | Найдено, % (n=5; р=0,95) | |||
x | S | Sx | Δ x | |
в крови | ||||
1,25 2,50 10,00 25,00 50,00 | 87,32 86,93 87,37 86,01 87,86 | 3,17 2,75 2,40 2,30 2,21 | 1,42 1,23 1,07 1,03 0,99 | 3,94 3,42 2,98 2,86 2,75 |
в плазме крови | ||||
1,25 2,50 10,00 25,00 50,00 | 95,24 96,12 95,83 96,02 96,18 | 2,91 2,42 2,08 1,95 1,92 | 1,30 1,09 0,93 0,87 0,86 | 3,62 3,02 2,58 2,42 2,39 |
Как показывают результаты, изменение содержания фелодипина в модельных смесях от 1,25 до 50,0 мг при постоянных массах навесок биологических жидкостей (25 г) сопровождается изменением среднего значения степени извлечения, не превышающим 1,85% для крови и 0,94% для плазмы крови. При содержании фелодипина в количестве 25 мг в 25 г биожидкости разработанные методики позволяют определить в крови 86,01–87,86%, а в плазме крови 95,64–96,18% данного вещества.
Таким образом, разработанные методики можно применять при исследовании биологических жидкостей на присутствие в них фелодипина.
Выводы
1. В качестве изолирующего агента рассмотрен ацетон. Оптимальными для изолирования фелодипина из биологических жидкостей признаны: настаивание с ацетоном (2 раза по 30 мин) и минимальное массовое отношение «ацетон-биоматериал» 2:1.
2. Эффективность очистки аналита достигнута в колонке сорбента «Силасорб С-18». Идентификацию фелодипина проводили методами тонкослойной хроматографии, спектрофотометрии и газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Для оценки количественного содержания исследуемого вещества предложена спектрофотометрия по поглощению в этаноле.
3. Разработанные методики определения фелодипина на основе изолирования ацетоном и очистки в колонке сорбента «Силасорб С-18» позволяют определить в крови до 87,86% и в плазме крови до 96,18% анализируемого соединения.
Об авторах
Лексо Лорикович Квачахия
Курский государственный медицинский университет
Email: R-WLADIMIR@yandex.ru
г. Курск, Россия
Владимир Камбулатович Шорманов
Курский государственный медицинский университет
Автор, ответственный за переписку.
Email: R-WLADIMIR@yandex.ru
г. Курск, Россия
Николай Сергеевич Кононенко
Курский государственный медицинский университет
Email: R-WLADIMIR@yandex.ru
г. Курск, Россия
Список литературы
- Машковский М.Д. Лекарственные средства. 16-е издание. М.: Новая Волна. 2012; 1216 с.
- Felodipine. Chemical Book. Available at: https://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB4300661.htm (access date 25.12.2018).
- Felodipine. ChemIDplus (A TOXNET DATABASE). Available at: https://chem.nlm.nih.gov/chemidplus/rn/72509-76-3 (access date 25.12.2018).
- Weinstein R.D., Hanlon W.H., Donohue J.P. et al. Solubility of Felodipine and Nitrendipine in liquid and supercritical Carbon Dioxide by cloud point and UV Spectroscopy. J. Chem. Eng. 2007; 52 (1): 256–260. doi: 10.1021/je0603729.
- Pandey M.M., Jaipal A., Kumar A. et al. Determination of pK(a) of felodipine using UV-Visible spectroscopy. Spectrochimica Acta. Part A, Mol. Biomolecular Spectroscopy. 2013; 115: 887–890. doi: 10.1016/j.saa.2013.07.001.
- St-Onge M., Dubé P.-A., Gosselin S. et al. Treatment for calcium channel blocker poisoning: A systematic review. Clin. Toxicol. (Phila.). 2014; 52 (9): 926–944. doi: 10.3109/15563650.2014.965827.
- Deters M., Friesecke S., Hentschel H. Fatal poisoning caused by felodipine. Clin. Toxicol. 2010; 48: 281–285.
- Lota H., Powell N., Negus R. et al. A case of fatal felodipine overdose. Acute med. 2008; 7 (1): 39–42.
- Yu P., Cheng H., Liu Z. et al. LC-MS/MS determination of felodipine in human plasma. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis. 2012; 32 (1): 35–39.
- Walash M., Belal F., El-Enany N., Zayed S. Micellar liquid chromatographic determination of felodipine in tablets and human plasma with fluorescence detection: Application to stability studies and content uniformity testing. Analytical methods. 2014; 6 (10): 3401–3409. doi: 10.1039/c3ay41570h.
- Migliorança L.H., Barrientos-Astigarraga R.E., Schug B.S. et al. Felodipine quantification in human plasma by high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2005; 814 (2): 217–223. doi: 10.1016/j.jchromb.2004.10.032.
- Chen M., Zhou J., Mei L. et al. Simultaneous determination of Felodipine and Metoprolol in beagle dog plasma by online SPE-LC-MS/MS and its application in a pharmacokinetic study. Analytical Sci. 2017; 33 (7): 755–759. doi: 10.2116/analsci.33.755.
- Квачахия Л.Л., Шорманов В.К. Идентификация нифедипина в биологических жидкостях. Фармация. 2013; 62 (8): 16–19.
- Sun H., Ai L., Wang F. Quantitative Analysis of Sulfonamide residues in Natural Animal Casings by HPLC. Chromatographia. 2007; 66 (5–6): 333–337. doi: 10.1365/s10337-007-0329-0.
- Шорманов В.К., Коваленко Е.А., Дурицын Е.П. и др. Определение карбофурана при судебно-химическом исследовании биологического материала. Суд.-мед. экспертиза. 2013; 56 (4): 30–34.
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)