Effect of bromfenac on free radical oxidation in model systems

E F Galimova; Галимова Эльмира Фанисовна; Z G Khaibullina; Хайбуллина Зульфия Гатиятовна; D A Enikeev; Еникеев Дамир Ахметович; Yu L Bortsova; Борцова Юлия Львовна; K S Mochalov; Мочалов Константин Сергеевич; S Sh Galimova; Галимова Саида Шамилевна; O Yu Travnikov; Травников Олег Юрьевич; T S Asadullina; Асадуллина Танзиля Салаватовна; K S Aver’yanova; Аверьянова Кира Сергеевна

doi:10.17816/KMJ2019-636

Влияние бромфенака на свободнорадикальное окисление в модельных системах

Авторы: Галимова Э.Ф.¹, Хайбуллина З.Г.¹, Еникеев Д.А.¹, Борцова Ю.Л.¹, Мочалов К.С.¹, Галимова С.Ш.¹, Травников О.Ю.¹, Асадуллина Т.С.¹, Аверьянова К.С.¹
Учреждения:
1. Башкирский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 100, № 4 (2019)
Страницы: 636-641
Тип: Экспериментальная медицина
Статья получена: 30.07.2019
Статья одобрена: 30.07.2019
Статья опубликована: 31.07.2019
URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/15531
DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2019-636
ID: 15531

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Исследование процессов свободнорадикального окисления в эксперименте на модельных системах при использовании противовоспалительного препарата бромфенака (наквана), широко применяемого в офтальмологии для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний передней камеры глаза.

Методы. Антиокислительную способность препарата оценивали методом регистрации хемилюминесценции и анализа модельных систем, генерирующих активные формы кислорода и воспроизводящих процессы перекисного окисления липидов с помощью хемилюминомера ХЛ-003. Определяли следующие параметры спонтанной и индуцированной хемилюминесценции: светосумму и максимальную амплитуду свечения, продолжительность латентного периода, амплитуду быстрой и медленной вспышки.

Результаты. При тестировании in vitro в двух разных вариантах модельных систем установлена высокая антиоксидантная активность исследуемого препарата, вплоть до полного подавления хемилюминесценции при добавлении 90 мкг бромфенака в инкубационную среду, что свидетельствует об угнетении процессов генерации активных форм кислорода. Продемонстрировано также достоверное увеличение суммарной антиокислительной активности на фоне бромфенака, о чём судили по величине интегрального параметра хемилюминесценции — светосуммы свечения, которая снижалась при введении 10 мкг препарата в 1,2 раза, а 90 мкг — в 1,5 раза. При сравнительном анализе антиоксидантных свойств различных нестероидных противовоспалительных средств, используемых в офтальмологической практике, продемонстрирована более выраженная эффективность бромфенака на фоне кеторолака, применение которого не сопровождалось статистически значимыми изменениями хемилюминесценции. Принципиально важная особенность механизма позитивного влияния бромфенака — прямая зависимость характера действия от его количества в реакционной среде, что открывает перспективы управляемой коррекции свободнорадикальных явлений и избыточной активации перекисного окисления липидов при нарушении баланса про- и антиоксидантных процессов в биологических системах.

Вывод. Сделано предположение, что протективные эффекты препарата при различных инфекционно-воспалительных поражениях глаз могут быть детерминированы — наряду с ранее известными свойствами, его антиоксидантной активностью, ограничением повышенного образования активных форм кислорода и явлений окислительного стресса.

Ключевые слова

офтальмология, бромфенак, окислительный стресс, свободнорадикальное окисление, хемилюминесценция

Полный текст

Воспалительные процессы сосудистого тракта передней камеры глаза составляют от 7 до 30% в общей структуре заболеваний глаз [1]. Наиболее часто они возникают у людей молодого возраста в связи с активным применением контактных линз, приводящим к воспалительным процессам передней камеры и снижению зрительной функции. Инфекционно-воспалительные заболевания переднего отрезка глаза могут развиться и как осложнение острых респираторных вирусных инфекций, например при аденовирусной инфекции, и при наличии определённых факторов риска, в частности при снижении местного и общего иммунитета.

Современная офтальмология основывается на разработке безопасных методов лечения, а также активном внедрении неинвазивных диагностических подходов. Существуют критерии для препаратов, применяемых в офтальмологической практике:
– во-первых, высокая бактерицидная активность, быстрое проникновение в переднюю камеру глаза, склеру, цилиарное тело;
– во-вторых, хорошая переносимость и отсутствие неприятных ощущений при применении;
– в-третьих, осмолярность препарата, вязкость и водородный показатель (рН) должны соответствовать показателям слёзной жидкости [2].

Предметом наших исследований стал поиск объективного метода диагностики динамики воспалительных изменений передней камеры глазного яблока на фоне лекарственной коррекции. Был использован широко применяемый в офтальмологической практике препарат бромфенак.

Офтальмологический раствор бромфенака (наквана) служит нестероидным противовоспалительным препаратом, уникальность которого заключается в химической структуре, что определяет его выраженные ингибирующие свойства в отношении циклооксигеназы-2 и высокую липофильность, которая позволяет быстро проникать во все ткани глаза и поддерживать в них постоянную концентрацию [3–5]. На клиническом уровне данные фармакокинетические свойства проявляются в быстром уменьшении выраженности воспалительного процесса и купировании боли.

Бромфенак эффективен как в монотерапии, так и в комбинации со стероидами. Впервые исследования данного препарата были проведены Ohara и соавт., которые использовали его для профилактики миоза во время оперативного вмешательства по экстракции катаракты и установили, что бромфенак обладает выраженным антимиотическим эффектом [6].

Вместе с тем, молекулярные механизмы антиокислительного действия бромфенака остаются не вполне ясными, что послужило предпосылкой для выполнения настоящего исследования. В частности, в литературе не освещено его влияние на свободнорадикальные процессы in vitro в модельных системах, что представляет интерес для комплексной оценки его эффективности.

Оценку влияния бромфенака на свободнорадикальные процессы проводили посредством хемилюминесцентного анализа в модельных системах, генерирующих активные формы кислорода, с использованием портативного хемилюминомера ХЛ-003 [7]. Перед измерением свечения исследуемый объём 0,09% раствора препарата смешивали с 2 мл изотонического раствора натрия хлорида, содержащего люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10–5 М, помещали в светоизолированную камеру прибора, перемешивали и вели запись хемилюминесценции (ХЛ) при 37 °C в течение 5 мин.

Для регистрации Fe2+-индуцированной ХЛ препарат добавляли к модельной системе, генерирующей активные формы кислорода. Образование активных форм инициировали введением 1 мл 50 мМ раствора сульфата железа. Конечная концентрация FeSO4 в среде инкубации составляла 2,5 мM. Реакция сопровождалась ХЛ, избирательно усиливающейся в присутствии люминола. Запись свечения проводили в течение 5 мин при постоянном перемешивании.

При оценке Fe2+-индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения, продолжительность латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Оценивали также амплитуду быстрой и медленной вспышки. Об интенсивности люминол-зависимой ХЛ судили по светосумме и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования активных форм кислорода.

Антиокислительную активность препарата в биологической среде тестировали при его добавлении к липидам, полученным из куриного желтка, содержащего липопротеиновые комплексы, сходные с липидами крови. Желток смешивали с фосфатным буфером в соотношении 1:5, гомогенизировали, доводили содержание белка до 1 мг/мл последовательным разведением (в среднем 25 мл гомогената на 1 л буфера). Отбирали 20 мл смеси, ХЛ инициировали добавлением 1 мл 50 мМ раствора сульфата железа при постоянном перемешивании, что приводило к окислению ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов.

Для статистической обработки использовали пакет прикладных программ Statistica 10.0 for Windows (StatSoft, Inc.). Данные обработаны непараметрическими методами и представлены в виде средней арифметической величины (M) и стандартной ошибки средней арифметической (m). Различия изучали с использованием U-теста Манна–Уитни. Достоверными считали результаты при уровне значимости p ≤0,05.

Информативным и удобным способом оценки изменения свободнорадикальных процессов служит измерение ХЛ — свечения, возникающего при образовании свободных радикалов в биологических образцах и тест-системах. Судить о про- или антиокислительной активности препаратов in vitro можно по изменению интенсивности ХЛ при добавлении в модельные системы [8].

Полученные данные (рис. 1) свидетельствуют о высокой антиокислительной активности препарата: добавление бромфенака в среду инкубации в количестве от 5 до 90 мкг значительно подавляет свечение модельной системы. Отметим, что в офтальмологической практике бромфенак назначают в виде инсталляций в конъюнктивальный мешок по 1 капле 0,9% раствора однократно, то есть разовая доза препарата составляет ориентировочно 45 мкг. Следовательно, бромфенак обладает антиоксидантной активностью в концентрациях, близких к дозе, используемой при лечении воспалительных процессов в передней камере глаза.

Рис. 1. Запись хемилюминесценции в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода, при добавлении бромфенака: 1 — контроль; 2 — 5 мкг; 3 — 10 мкг; 4 — 30 мкг; 5 — 90 мкг

Антиокислительный эффект был дозозависимым: с повышением количества изучаемого препарата происходило снижение интенсивности ХЛ вплоть до полного подавления свечения, что открывает возможности для управления свободнорадикальными процессами путём изменения его уровня.

Для выявления антиокислительных эффектов бромфенака в биологической среде была дана оценка его действия на перекисное окисление липидов. С этой целью препарат добавляли к липидам куриного белка, сходным по составу с липидами крови.

На представленных записях видно, как уменьшаются показатели медленной вспышки при добавлении бромфенака (рис. 2), то есть антиокислительные свойства сохраняются и в биологической среде.

Рис. 2. Запись хемилюминесценции в модельной системе, инициирующей реакции перекисного окисления липидов, при добавлении бромфенака: 1 — контроль; 2 — 5 мкг; 3 — 10 мкг; 4 — 30 мкг; 5 — 90 мкг

В качестве интегрального параметра интенсивности ХЛ рассматривают светосумму свечения, которую регистрируют в течение 5 мин инкубации. Показатели люминол-зависимой ХЛ представлены в табл. 1.

Таблица 1. Уровень люминол-зависимой хемилюминесценции в модельной системе при добавлении бромфенака (усл.ед.), n=30

Параметр	Контроль	Бромфенак, 10 мкг	p	Бромфенак, 90 мкг	p
Светосумма	3,5±0,15	2,8±0,21	0,008815	2,3±0,19	0,000007
Спонтанная светимость	1,12±0,05	1,3±0,2	0,386257	0,8±0,19	0,108880
Максимальная светимость	1,54±0,05	1,2±0,17	0,060031	1,1±0,1	0,000228

Примечание: в таблицах результаты представлены в виде M±m, где M — средняя арифметическая величина; m — стандартная ошибка средней арифметической; р — уровень статистической значимости различий.

Исследование суммарной антиокислительной активности при добавлении разных доз препарата выявило достоверные различия между показателями светосуммы, которые на фоне бромфенака в дозе 10 мкг снижались более чем в 1,2 раза, 90 мкг — в 1,5 раза. Показано, что величина светосуммы ХЛ определяет потенциальную способность липидов подвергаться окислению [7].

Приблизительно в той же степени под влиянием протестированных доз уменьшались значения максимальной светимости, что указывает на повышение антиокислительной активности. Данные различия свидетельствуют о том, что бромфенак при применении in vivo может усиливать защитные свойства слёзной жидкости благодаря повышению уровня суммарной антиокислительной активности.

В патогенезе воспаления тканей глаза особое место принадлежит арахидоновой кислоте, которая при участии изоферментов циклооксигеназы-1 и -2 быстро превращается в эйкозаноиды, прежде всего в простагландины — одни из самых важных липидных медиаторов воспаления [9]. В свою очередь арахидоновая кислота образуется из мембранных фосфолипидов при участии фосфолипазы А2 и представляет собой источник для синтеза различных типов простагландинов. Простагландины вызывают повышение проницаемости сосудов передней камеры с увеличением концентрации белка во внутриглазной жидкости, тем самым повышая внутриглазное давление с последующим увеличением проницаемости гематоофтальмического барьера.

Постулируемый механизм действия бромфенака заключается в ингибировании циклооксигеназы-2. В некоторых работах утверждают, что раствор бромфенака клинически эффективен не только для лечения глазного воспаления и уменьшения глазной боли после удаления катаракты (стандартного назначения, одобренного в настоящее время в США), но и в ряде других терапевтических и хирургических ситуаций [10].

Сравнительные исследования безопасности, фармакокинетики и фармакодинамики бромфенака и аналогичных нестероидных противовоспалительных препаратов выявили его преимущества в отношении подавления образования простагландина E2 при различных патологических состояниях, а также высокую эффективность в низких концентрациях при меньшей частоте введения и более доступной стоимости [11, 12].

Установленные в нашей работе сведения о выраженной антиоксидантной активности бромфенака демонстрируют неизвестные и не описанные ранее в литературе свойства соединений этого ряда, что открывает новые потенциальные области их применения.

В этой связи примечательны результаты выполненной нами сравнительной оценки антиоксидантной характеристики бромфенака и кеторолака, также относящегося к классу нестероидных противовоспалительных препаратов и используемого в глазной практике (рис. 3).

Рис. 3. Запись хемилюминесценции в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода, при добавлении 10 мкг бромфенака (3), 45 мкг кеторолака (2); отдельно представлен контроль (1)

Как следует из этих данных, кеторолак обладает низкой антиокислительной активностью, его нельзя рассматривать как средство нормализации окислительно-восстановительных процессов при офтальмологической патологии.

Столь же неэффективен был кеторолак и в отношении влияния на суммарную антиокислительную активность (табл. 2), что свидетельствует об отсутствии его способности нормализовать антиоксидантную ёмкость системы при угрозе развития окислительного стресса.

Таблица 2. Уровень люминол-зависимой хемилюминесценции в модельной системе при добавлении кеторолака (усл.ед.), n=30

Параметр	Контроль	Кеторолак, 45 мкг	p	Кеторолак, 450 мкг	p
Светосумма	3,6±0,13	3,3±0,19	0,19	3,2±0,22	0,12
Спонтанная светимость	1,05±0,04	1,1±0,12	0,69	0,9±0,11	0,20
Максимальная светимость	1,47±0,06	1,3±0,13	0,24	1,2±0,14	0,08

Следовательно, в условиях наших экспериментов обнаружено, что противовоспалительные свойства бромфенака могут быть обусловлены не только изменением активности циклооксигеназы, но и модуляцией баланса про- и антиоксидантных систем.

Выводы

1. При тестировании бромфенака в модельных системах установлена дозозависимая антиокислительная активность. Полученные данные свидетельствуют о необходимости подбора оптимальной дозы препарата, использование которой не будет инициировать нарушений баланса между образованием активных форм кислорода и антиоксидантной способностью.

2. В перспективе появляется возможность для контроля свободнорадикальных процессов в широком диапазоне концентраций, что после проведения дополнительных исследований позволит рекомендовать использование данного препарата в качестве средства нормализации про- и антиоксидантного баланса в передней камере глаза при инфекционно-воспалительных процессах.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.