Mechanisms of the resistance of gastrointestinal stromal tumors to imatinib

Full Text

Гастроинтестинальные стромальные опухоли (ГИСО) являются мезенхимальными новообразованиями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [1]. Термин «gastrointestinal stromal tumor» (гастроинтестинальная стромальная опухоль) был введен Mazur M.T. и Clark H.B. в 1983 г. [2] для описания опухолей ЖКТ, классифицируемых световой микроскопией как лейо­миома, лейомиосаркома или лейомиобластома и демонстрирующих ультраструктурные и иммуногистохимические особенности, которые давали возможность определять их негладкомышечное происхождение.

Прорыв в понимании патогенеза ГИСО был осуществлен в 1998 г. после иммуногистохимического обнаружения на поверхности клеток ГИСО гиперэкспрессии тирозинкиназного рецептора KIT. К тому же при сравнительной оценке экспрессии KIT в клетках ГИСО и интерстициальных клетках Кахала (ИКК) (the interstitial cells of Cajal (ICCs) оказалось, что эти клетки имеют общий фенотип (KIT) и морфологическое сходство. ИКК представляют собой пейсмекерные клетки, располагающиеся в мышечном слое ЖКТ. Данные клетки обеспечивают физиологический ритм спонтанной перистальтики всех отделов ЖКТ за счет передачи медленных электрических потенциа­лов на гладкую мышечную ткань. Данные результаты позволили предположить, что ГИСО развивается из ИКК или их плюрипотентных клеток-предшественников [3].

Также были обнаружены мутации в гене KIT, приводящие к лиганд-независимой активации этой тирозинкиназы [2]. Продуктом гена KIT является рецепторная тирозинкиназа KIT, также известная как CD117 (145 kDa), располагающаяся на клеточной мембране. В физиологических условиях взаимодействие KIT-рецептора со своим лигандом (фактором роста стволовых клеток — stem cell factor, SCF) приводит к димеризации рецептора с последующей активацией его внутриклеточного АТФ-связывающего и тирозинкиназного доменов. Затем происходит фосфорилирование тирозиновых остатков целого ряда внутриклеточных сигнальных белков, включая пути RAS/MAPK, PI3K/AKT и JAK/STAT [4, 5], что обуславливает передачу сигнала в ядро ­клетки. В клеточном ядре запускаются ­процессы ­клеточной пролиферации, дифференцировки, а также подавления апоптоза.

До 70–85 % мутаций обнаруживается в гене KIT в экзонах 11 и 9, около 5 % мутаций приходится на ген, кодирующий тирозинкиназный альфа-рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFRA) [6–8]. Именно данные мутации в подавляющем числе случаев являются определяющими в патогенезе ГИСО.

В результате обнаруженных иммуногистохимических и молекулярно-генетических особенностей данных новообразований термин «ГИСО» в 2002 г. был окончательно выделен в отдельную нозологическую группу для описания мезенхимальных новообразований ЖКТ, являющихся KIT-позитивными и имеющих активирующие мутации в генах KIT или PDGFRA. Тем не менее, следует отметить, что незначительная часть ГИСО (до 10 %), не имеет данных признаков [9].

Заболеваемость ГИСО варьируется от 2,1 до 19,7 случаев на миллион человек. ГИСО несколько чаще встречается у мужчин, чем у женщин, средний возрастной диапазон приходится на 60 лет. С клинической точки зрения ГИСО являются чрезвычайно гетерогенными. Они могут возникать во всех отделах ЖКТ, начиная от нижней части пищевода, заканчивая прямой кишкой. Чаще всего поражается желудок (60–70 %), за которым следует тонкая кишка (25–35 %) и толстый кишечник (5 %) [10–16]. Менее чем в 10 % случаев ГИСО локализуется в сальнике, брыжейке тонкой или толстой кишок, пищеводе, забрюшинном пространстве и нетипичных органах, таких как предстательная железа, матка, поджелудочная железа. Макроскопически ГИСО — это мягкотканные опухоли с хорошим кровоснабжение и, как правило, имеющие псевдокапсулу. Желудочные ГИСО имеют солидную или гнездную форму, часто с гиалинизированной стромой и миксоидными изменениями. В тонкой кишке ГИСО чаще веретеновидные, а не эпителиоидные, и могут демонстрировать параганглиматозный рисунок. Более 95 % ГИСО CD117-позитивны, 60–70 % CD34-позитивны (маркер мезенхимальных / гемопоэтических клеток-предшественников). В 15–60 % в ГИСО обнаруживается виментин и гладкомышечный актин. В 10–15 % ГИСО не выявляются мутации KIT или PDGFRA (­дикий тип ГИСО). Отсутствие данных мутаций не исключает диагноза «ГИСО». DOG1 — это кальций-зависимый, рецептор-активируемый хлорный канал, экспрессируемый в ГИСО; его экспрессия не зависит от мутационного статуса, и может быть использован для диагностики KIT-негативных опухолей [17].

После обнаружения в клетках ГИСО активирующей мутации KIT в 2001 г. была предпринята попытка использования таргетного препарата «Иматиниба мезилат» (ИМ, Гливек) в лечении пациентки с диссеминированной формой ГИСО. Данный препарат является ингибитором нескольких рецепторных тирозинкиназ с различным сродством, включая KIT, слитый белок BCR-ABL и PDGFRA. Результаты терапии данной пациентки оказались настолько ошеломляющими, что после данного случая препарат достаточно быстро стал применяться в качестве монотерапии данного заболевания [18]. Важно отметить, что до внедрения ИМ в клиническую практику прогноз пациентов с диссеминированными, метастатическими и рецидивирующими ГИСО значился неблагоприятным, так как ГИСО считались резистентными к химио- и лучевой терапии, и выживаемость больных с данной патоло­гией зависела исключительно от степени распространенности и радикальности оперативного удаления опухоли [19–22].

В настоящее время установлено, что молекулярно-генетические различия ГИСО могут являться определяющими эффективность проведения таргетной терапии ИМ (табл. 1). Например, наиболее высокая чувствительность к ИМ доказана для опухолей с первичными мутациями KIT в 11 экзоне, меньшая — при мутациях в 9 экзоне (требует 2-кратного увеличения суточной дозы препарата до 800 мг/сут, см. ниже), а резистентность к ИМ показана для ГИСО с «диким типом» генов KIT и PDGFRА, что является наиболее распространенным для ГИСО детского возраста [23].

Таблица 1. Эффективность иматиниба мезилат (ИМ) в отношении различных молекулярно-генетических типов гастроинтестинальной стромальной опухоли (ГИСО)

Важно отметить, что, несмотря на высокую эффективность применения ИМ у больных с ГИСО, более чем у 50 % пациентов после проведения таргетной терапии ИМ (вне зависимости от характера мутационного статуса KIT и PDFRA) в течение 2-х лет развивается устойчивость к данному препарату [24, 25]. Потому в настоящее время принято разделять первичную и вторичную резистентности ГИСО к ИМ. Первичная резистентность (ПР) определяется как прогрессирование процесса в течение первых 6 мес. непрерывной терапии ИМ. Приблизительно 10–14 % пациентов с ГИСО не ­отвечают на таргетную терапию ИМ [26, 27]. Как уже было отмечено выше, ПР к ИМ во многом обусловлена молекулярно-генетическими особенностями ГИСО [18, 28, 29]. Наиболее распространенными мутациями, придающими ПР к ИМ, являются мутации в 9 экзоне гена KIT (подавляющее большинство из которых являются внутренним тандемным дублированием AY502-503) и в 18 экзоне гена PDGFRA (замена D842V) [30]. В случае обнаружения мутаций в 9 экзоне гена KIT терапевтический эффект препарата может быть достигнут за счет двукратного повышения его дозы (до 800 мг/сут), в то время как для других пациентов с ПР («дикий тип» KIT, мутации PDGFRA) данный терапевтический подход является неэффективным [18, 31]. Мутации гена, кодирующего комплекс субъединиц сукцинатдегидрогеназы (SDH), гена нейрофибромина 1 (NF1), протоонкогена B-raf (BRAF), «эпимутации» (обусловленные эпигенетической изменчивостью) гена SDHC и более редкие мутации, включая гены PI3K3CA, CBL и KRAS, также сопровождаются ПР к ИМ [25, 32]. Следовательно, для пациентов с этими мутациями необходима другая терапевтическая стратегия, и использование ингибиторов BRAF, MEK и VEGFR было бы логичным альтернативным подходом. Следует подчеркнуть, что мутации в генах KIT, PDGFRA и BRAF являются взаимоисключающими [33]. ГИСО c мутацией BRAF часто локализуются в тонкой кишке, являются высокозлокачественными и обнаруживаются менее чем в 1 % случаев [17].

Вторичная резистентность (ВР) определяется как развитие устойчивости к ИМ в результате проведения таргетной терапии с положительным терапевтическим эффектом в начале лечения (более 6 мес.) [34]. ВР, как правило, развивается в результате приобретенных (вторичных) мутаций [25, 35]. Большинство мутаций, приводящих к ВР, сопровождаются мутациями KIT и PDGFRA [30, 36–38]. Мутации KIT обнаруживаются преимущественно в 2 регионах внутриклеточной киназной области [17]. Первый находится в тиразинкиназном АТФ-связывающем домене (ТК1) и препятствует связыванию с лекарственным средством (экзоны 13 (V654A) и 14 (T670I, T701I), а второй — в тирозинкиназном домене (ТК2), обладающем киназной активностью, где мутации могут стабилизировать KIT в активной конформации и затруднять взаимодействие с лекарст­венным средством (экзоны 17 (D816A/G/H/V, D820A/E/G/Y, Y823D) и 18 (D842V) [27, 30]. Мутации KIT в экзоне 17 составляют 30–40 % от вторичных мутаций KIT, которые приводят к формированию резистентности ко всем новым ингибиторам тирозинкиназ, включая сунитиниб, сорафениб, дазатиниб и нилотиниб. Некоторые вторичные мутации находятся в 15 и 16 экзонах гена KIT, кодирующих киназную вставку [5].

Важно также отметить наличие молекулярно-генетической гетерогенности между первичными ГИСО и их метастазами, развивающимися на фоне проведения таргетной терапии ИМ. Является очевидным, что данные различия также могут влиять на эффективность дальнейшего проведения таргетной терапии вследствие развития лекарственной устойчивости как материнской опухоли, так и метастатических очагов [30, 38–40]. Например, Liegl с соавт. изучали мутационный статус KIT и PDGFRA в 53 метастазах ГИСО, полученных у 14 пациентов, которым после прогрессирования на фоне терапии ИМ или сунитинибом была проведена хирургическая дебуляция. Первичные KIT-онкогенные мутации были обнаружены у 11 из 14 пациентов (79 %). Из них 9 (83 %) имели вторичные лекарственно-устойчивые мутации KIT, в том числе 6 (67 %) с 2–5 различными вторичными мутациями в отдельных метастазах и 3 (34 %) с двумя вторичными мутациями KIT в тех же метастазах. Проведение FISH-анализа выявило амплификаты KIT в 2 из 10 метастазов, не имеющих вторичных мутаций KIT. Таким образом, была показана обширная внутриклональная и межклональная гетерогенность мутаций и амплификаций ­генов, обуславливающих резистентность к ИМ у пациентов с клинически прогрессирующими ГИСО [39].

Помимо вторичных мутаций KIT, ВР клеток ГИСО к ИМ может быть обусловлена потерей экспрессии KIT, сочетающейся гиперэкспрессией рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ (MET, AXL, FAK и др.). Sakamoto K. и его коллеги выявили потерю экспрессии KIT в клетках ГИСО в 7 из 33 случаев. Важно подчеркнуть, что в 4 из 7 случаев потеря экспрессии KIT была спонтанной, так как таргетная терапия ИМ или сунитинибом не применялась, что свидетельствовало о новом механизме ПР к ИМ. В остальных случаях ГИСО была выявлена гиперэкспрессия других тирозинкиназных рецепторов, таких как PDGFRB, MET или EGFR, играющих, как известно, важную роль в регуляции пролиферации опухолевых клеток, их апоптоза и чувствительности к лекарственной терапии (см. ниже), что ­могло ­обуславливать формирование альтернативных механизмов резистентности к ИМ, приводя тем самым к прогрессированию опухоли [41, 42]. Альтернативные механизмы ВР к ИМ могут быть обусловлены также мутациями BRAF [43].

Рецепторная тирозинкиназа MET является продуктом протоонкогена MET и участвует в канцерогенезе, ангиогенезе и метастазировании опухоли. Связывание МЕТ с фактором роста гепатоцитов (hepar grow factor, HGF) активирует фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K), митоген-активированную протеинкиназу (MAPK), Янус-киназу, сигнал трансдукции и активации транскрипции (JAK-STAT), Src-сигнальные пути трансдукции, причем все вышеперечисленные сигнальные пути находятся ниже KIT. Cohen N.A. и соавт. выявили низкую экспрессию KIT и PDGFRА, более высокую экспрессию активированных MET (без гиперпродукции HGF) и AXL в клетках ГИСО с устойчивостью к ИМ [44].

AXL (от греч. аnexelekto — неконтролиру­емый) является также рецепторной тирозинкиназой. Mahadevan D. c соавт. обнаружили, что ИМ-резистентные ГИСО приобрели устойчивость к ИМ в результате так называемого «киназного переключения», т.е. потери экспрессии KIT и одновременно повышения экспрессии AXL. Результаты проведенного молекулярного докинга с использованием гомологичных моделей доменов MET и AXL показали, что ИМ не связывается с этими рецепторными тирозинкиназами, чем и определяет резистентность к ИМ [45].

FAK является нерецепторной тирозинкиназой, которая активируется посредством аутофосфорилирования по остаткам Tyr в положении 397. Выявлено, что FAK гиперэкспрессируется в высокозлокачественные ГИСО и коррелирует с частотой возникновения рецидивов заболевания. Кроме того, активация FAK ассоциирована с резистентностью к ИМ при мутации KIT в 17 экзоне, но не в 11 экзоне. Результаты Takahashi T. и др. продемострировали, что ИМ активировал FAK в ИМ-чувствительных клетках ГИСО с мутацией KIT в 11 экзоне. Кроме того, использование у этих клеток FAK-ингибитора TAG372 или siRNA снижает их жизнеспособность под влиянием ИМ [46].

Нашей научной группой [47] были изучены механизмы ВР ГИСО к ИМ. Был выделен ИМ-резистентный субклон из ИМ-чувствительной клеточной линии для сравнительного анализа мутационного статуса, уровня экспрессии KIT и альтернативных тирозинкиназ. Молекулярное исследование гена KIT не выявило наличия вторичных мутаций. В то же время сравнительное исследование экспрессии рецепторных тирозинкиназ у ИМ-чувствительных и резистентных клеток ГИСО выявило существенные различия. У ИМ-резистентных клеток отмечалось снижение экспрессии фосфорилированных форм KIT (pKIT) и PDGFRA (pPDGFRA), а также значительное повышение экспрессии фосфорилированной формы тирозинкиназного рецептора фактора роста фибробластов-2α (pFGFR2α). Важно отметить, что воздействие BGJ398, селективного ингибитора FGFR-сигнального пути приводило к ресенситизации ИМ-резистентных ГИСО к ИМ. Данный эффект был нами обнаружен как in vitro, так и in vivo с использованием ксенографтных моделей. Важно отметить, что комбинированное использование 2-х ингибиторов (иматиниба и BGJ398) приводило к замедлению роста ИМ-резистентных ксенографтных опухолей ГИСО и индуцировало апоптоз. Примечательно, что при использовании тирозинкиназных ингибиторов в отдельности не было выявлено аналогичного эффекта.

Результаты наших исследований показывают, что формирование ВР клеток ГИСО к ИМ было обусловлено «киназным переключением», т.е. потерей экспрессии pKIT и pPDGFRA, активацией FGFR-сигнального пути, приводящих к последующей клеточной пролиферации.

Таким образом, можно заключить, что механизмы развития ПР в клетках ГИСО обусловлены в основном мутационным статусом генов KIT и PDGFRA и, реже, мутациями в генах SDH, NF1, BRAF, PI3K3CA, CBL и KRAS. Механизмы формирования ВР клеток ГИСО к ИМ могут быть обусловлены не только появлением вторичных мутаций в генах KIT и PDGFRA, но и потерей экспрессии KIT, сочетающейся с гиперэкспрессией рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ (MET, AXL, FGFR2α, FAK и др.). Также альтернативные механизмы ВР могут быть связаны с мутациями BRAF.

Работа выполнена при поддержке Российского Научного Фонда (грант № 14-15-00342-П).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

A R Galembikova

Author for correspondence.
Email: ailuk000@mail.ru
Kazan, Russia

S V Boichuk

Email: ailuk000@mail.ru
Kazan, Russia

References

Supplementary files