Реакция системы гемостаза при гиперкапнической гипоксии после курсового применения мексидола с использованием метода тромбоэластографии

Полный текст

Острая гиперкапническая гипоксия (ГГ) может возникнуть при нарушении штатной работы системы кислородообеспечения, когда в воздухе герметического объекта содержание кислорода снижается, а концентрация углекислого газа увеличивается. Также ГГ наблюдается при некоторых заболеваниях ­сердечно-сосудистой, дыхательной систем и сис­темы крови [1, 2].

Установлено, что ГГ вызывает в организме человека и животных сложную интегральную реакцию, определенная роль в которой принадлежит системе гемостаза [3, 4]. Ранее было выявлено, что различные режимы ГГ приводят к смещению гемостатического баланса в сторону тромбинемии [5, 6]. В то же время в других исследованиях показано, что ГГ вызывает активацию тромбоцитарного звена, гипокоагуляцию коагуляционного звена [7] и активацию фибринолитической системы крови [8].

В настоящее время для обеспечения выживаемости человека в условиях острой ГГ используются в основном средства индивидуального жизнеобеспечения [2, 9]. Однако их применение ограничено из-за громоздкос­ти, большой стоимости, сложности эксплуатации и способности ограничивать движения и обзор, а также затруднять прием пищи, воды и т.п. [1, 10]. В то же время поддержание жизнеспособности в условиях острой гипоксии на дос­таточно высоком уровне возможно с помощью лекарственных средств, обладающих антигипоксическими свойствами [11].

Дефицит энергии, лежащий в основе любой формы гипоксии, в том числе и при ГГ, приводит к качественно однотипным метаболическим и структурным сдвигам в различных органах и тканях: возникновению ацидоза, активации свободно-радикального окисления, повреждению биологических мембран, затрагивающему как липидный бислой, так и мембранные белки. Среди фармакологических препаратов метаболического типа действия особое место занимает антигипоксант мексидол [11], представляющий собой сукцинатсодержащее производное 3-оксипиридина (2-этил-6-­метил-3-оксипиридина сукцинат) [12].

Мексидол подавляет агрегацию тром­боци­тов, вызываемую коллагеном, тромбином, АДФ и арахидоновой кислотой, ингибирует фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов тромбоцитов, а также защищает клетки крови при механической травме [13]. Установлено, что мексидол обеспечивает подавление агрегации и адгезии тромбоцитов и лейкоцитов, по­вышает пластичность эритроцитов, улуч­шает реологические свойства крови, что спо­собствует устранению нормокапнической гипоксии [14].

Показано, что при нормокапнической гипоксии со стороны системы гемостаза мексидол нормализует как сосудисто-­тромбоцитарные (что проявляется в сохранности самих кровяных пластинок и их свойств), так и коагуляцион­ные механизмы, а также фибринолитические свойства крови. Это может быть основанием применения препарата при нарушениях гемостаза, вызванных воздействием нормокапнической гипоксии [8, 15].

Стоит отметить однако, что данные об эффективности применения антигипоксантов при моделировании ГГ в литературе отсутствуют.

В связи с вышеизложенным целью настоя­щей работы стало изучение реакции системы гемостаза на однократное воздействие ­гиперкапнической гипоксии максимальной интенсивности у крыс и возможность коррекции гемостазиологических нарушений с помощью предварительного курсового применения ­мексидола.

Исследования выполнены на 48 половозрелых крысах-самцах линии Wistar сред­ней массой 259,0 ± 36,0 г. Все экспериментальные животные были разделены на 4 группы: две контрольные (n = 12 × 2) и две опытные (n = 12 × 2).

1-я и 2-я опытные группы подвергались однократному воздействию ГГ максимальной интенсивности путем помещения крыс на 20 мин в камеры с газовой средой, содержащей 5,0 ± 0,5 % О₂ и 5,0 ± 0,5 % СО₂. Кроме того, 2-й опытной группе животных за 1,5 ч (время обусловлено пиком концентрации препарата в плазме крови [14]) до воздействия гиперкапнической гипоксии предварительно на протяжении 30 дней ежедневно осуществлялось внутрибрюшинное введение мексидола (50 мг/кг).

Режим максимальной интенсивности воздействия гиперкапнической гипоксии был подобран экспериментальным путем, при котором наблюдалась 100 % выживаемость животных.

Контрольные группы помещались в ту же камеру на аналогичное по продолжительности время, что и опытные группы, однако в этом случае вместо газовой смеси компрессором нагнетался атмосферный воздух, а вместо мексидола осуществлялось введение 0,9 % раствора NaCl по той же схеме.

Для моделирования ГГ использовали спе­циальную проточную камеру, в которую при помощи компрессора подавалась заданная смесь газов со скоростью 15 л/мин. Камера имела выпускное отверстие, соединенное при помощи шланга с емкостью, наполненной водой, что обеспечивало стравливание из камеры повышенного давления газов. Контроль газового состава камеры производили при помощи газоанализатора «Microlux O₂ + CO₂» (ООО «Микролюкс», Екатеринбург, Россия).

Забор крови у всех групп животных выполняли на фоне наркотизации путем внутрибрюшинного введения раствора золетила в дозе 5 мг/100 г.

Кровь для исследования в объеме 5 мл получали путем забора из печеночного синуса в полистироловый шприц, содержащий 0,11 М (3,8 %) раствора натрия цитрата (соотношение крови и цитрата — 9:1) [16]. До проведения эксперимента на протяжении недельной адаптации к условиям вивария все крысы находились в стандартных условиях содержания согласно требованиям «Надлежащей ­лабораторной ­практики» (Good Laboratory Practice, GLP). Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте, а также Директивами 86/609/EEC [17]. Обезболивание и умерщвление животных проводили в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Работа была одобрена этическим комитетом ФГБОУ ВО АГМУ Мин­здрава РФ. Протокол № 1 от 29 января 2018 г.

В настоящей работе для оценки системы гемостаза использовался интегральный метод исследования — тромбоэластография. Запись тромбоэластограммы с использованием активатора «Start-tem» проводилась на аппарате «Rotem Gamma» (Германия) [18].

В ходе расшифровки тромбоэластограммы учитывались следующие показатели.

Время начала образования сгустка (СТ). Описывает время от начала анализа до распознаваемого начала формирования сгустка посредством добавления активатора (реагенты и кальций). Время начала образования сгустка является важным параметром активизации показателей свертывания, а также их баланса с соответствующими ингибиторами.

Время образования сгустка (CFT). Отображает кинетику образования стойкого сгустка из тромбоцитов и фибрина. Время образования сгустка зависит в основном от количества тромбоцитов и особенно от их участия в формировании сгустка. Кроме того, на время образования сгустка влияет уровень фибриногена и его склонность к полимеризации.

Угол альфа (α ̊) — угол, построенный по касательной к тромбоэластограмме из точки начала образования сгустка. Отображает скорость роста фибриновой сети и ее структурообразование (увеличение прочности сгустка).

Максимальная плотность сгустка (MCF) представляет собой максимальную величину амплитуды формирования сгустка, достигнутую к моменту, когда активируется процесс фибринолиза. Максимальная плотность сгустка является одним из наиболее важных парамет­ров в тромбоэластометрии.

Максимальный лизис (ML) соответствует максимальной интенсивности фибринолиза, обнаруженной в течение анализа, и определяется как нахождение самой низкой амплитуды после достижения MCF [18].

Все цифровые данные, полученные в ходе исследования, подвергались статистической обработке. Данные исследований представлены в виде m [25 % ÷ 75 %], где m — ­медиана в ­выборочной совокупности, [25 % ÷ 75 %] — 25-й и 75-й перцентили. Достоверность различий оценивали при помощи непараметрического U-критерия Манна — Уитни. Различия считались достоверными при уровне статистической значимости р < 0,05. Для обработки и хранения полученного экспериментального материала создавали базы данных с использованием редактора электронных таблиц Microsoft Excel 2010. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли при помощи программ математической статистики Jmp Statistical Discovery v 6.1.2 и Biostat 5.03 на персональном компьютере [16, 18].

Сравнительный анализ результатов данных тромбоэластографии, зарегистрированных после однократного воздействия ГГ максимальной интенсивности, без/после предварительного введения мексидола в течение 30 дней приведен в табл. 1.

 

Таблица 1. Показатели системы гемостаза плазмы крови крыс при однократном воздействии гиперкапнической ­гипоксии максимальной интенсивности без/после использования курсового приема мексидола (m [25 % ÷ 75 %])

Показатели	Однократное воздействие ГГ максимальной интенсивности (5,0 % О2, 5,0 % СО2)		Однократное воздействие ГГ максимальной интенсивности (5,0 % О2, 5,0 % СО2) после 30-кратного курсового применения мексидола (50 мг/кг)
	Контроль 1	Опыт 1	Контроль 2	Опыт 2
CT, с	236,0 [219,3 ÷ 252,8]	124,0*** [116,2 ÷ 140,3]	174,0 [168,2 ÷ 181,2]	188,7 [179,3 ÷ 190,5]
α ̊	59,0 [52,0 ÷ 64,0]	78,0** [72,3 ÷ 84,0]	62,8 [57,1 ÷ 69,5]	67,2 [64,0 ÷ 72,8]
CFT, с	124,0 [118,9 ÷ 128,3]	72,0*** [67,4 ÷ 76,0]	92,0 [88,2 ÷ 101,4]	88,4 [85,5 ÷ 95,6]
MCF, мм	67,0 [64,2 ÷ 73,6]	79,0 [70,6 ÷ 82,4]**	76,0 [68,4 ÷ 79,8]	68,0** [65,3 ÷ 71,0]
ML, %	1,0 [0,8 ÷ 1,3]	2,0 [1,8 ÷ 2,3]*	0,0 [0,0 ÷ 0,0]	0,0 [0,0 ÷ 0,0]

Примечание: обозначены статистически значимые отличия от соответствующих показателей группы контроля: * — при p < 0,05; ** — при p < 0,01; *** — при p < 0,001. ГГ — гиперкапническая гипоксия. СТ — время коагуляции; α — угловая константа; MCF — максимальная амплитуда ТЭГ; CFT — время образования сгустка; ML — максимальный лизис.

 

По данным тромбоэластографии после однократного воздействия ГГ максимальной интенсивности было зарегистрировано укорочение времени начала образования сгустка (CT) на 47,0 % (p < 0,001) на фоне повышения угла α ̊ на 32,0 % (p < 0,01) и максимальной плотности сгустка (MCF) на 18,0 % (p < 0,001). Также выраженно укорачивалось время образования сгустка (CFT) на 42,0 % (p < 0,001). Увеличение функциональной активности фибринолитичес­кой системы подтверждалось повышением показателя максимального лизиса (ML) в два раза (p < 0,05). Для наглядности полученных ­данных представлены тромбоэластограммы животных из контрольной и опытной групп (рис. 1, рис. 2). В описанных выше экспериментах показано, что однократное воздействие ГГ максимальной интенсивности без предшествующего курсового введения мексидола сопровождается активацией как тромбоцитарного, так и коагуляционного звеньев гемостаза, а также активацией фибринолитической системы крови.

 

Рис. 1. Тромбоэластограмма (контрольная группа, животное № 5), зарегистрированная после однократного пребывания в камере в течение 20 мин в условиях обычного атмосферного давления

 

Рис. 2. Тромбоэластограмма (опытная группа, животное № 1), зарегистрированная сразу после однократного воздействия гиперкапнической гипоксии максимальной интенсивности (О₂ — 5 %; СО₂ — 5 %) в течение 20 мин

 

Зафиксированные изменения частично подтверждаются результатами, полученными W.D. Toff (2006), показавшего, что вдыхание гиперкапнической смеси (5,0 % СО₂ в воздухе) стимулировало гемокоагуляцию вследствие усиления контактной и фосфолипидной активаций пусковых механизмов системы свертывания, повышения тромбопластиновой и тромбиновой активностей, снижения антикоагулянтного потенциала и неферментативного фибринолиза [8].

По данным тромбоэластографии при однократном воздействии ГГ максимальной интенсивности после курсового введения мексидола было зарегистрировано уменьшение показателя максимальной плотности сгустка (MCF) на 11 % (p < 0,01), по остальным показателям достоверных отличий зафиксировано не было. В качестве примера представлены тромбоэластограммы, полученные у животных из контрольной и опытной групп (рис. 3, рис. 4). Предварительное курсовое применение мексидола во многом нормализовало гемостазиологическую картину, зарегистрированную после однократного воздействия ГГ ­максимальной интенсивности. При этом было обнаружено лишь снижение максимальной плотности сгустка, что может быть связано со снижением количества тромбоцитов, а также угнетением их способности к агрегации. Этот факт может быть объяснен тем, что СО₂ способен стимулировать эндотелиальную NO-синтазу [19], приводящую к увеличению содержания в кровотоке NO, обладающего мощным дез- и антиагрегантным действием [20]. Кроме того, известно, что мексидол самостоятельно улучшает кровообращение в сосудистом русле, ингибируя агрегацию тромбоцитов и повышая антитромбогенный потенциал крови.

 

Рис. 3. Тромбоэластограмма (контрольная группа, животное № 3), зарегистрированная при однократном воздействии гиперкапнической гипоксии максимальной интенсивности (О₂ — 5 %, СО₂ — 5 %) в течение 20 мин после 30-кратного введения 0,9 % раствора NaCl

 

Рис. 4. Тромбоэластограмма (опытная группа, животное № 4), зарегистрированная при однократном воздействии гиперкапнической гипоксии максимальной интенсивности (О₂ — 5 %, СО₂ — 5 %) в течение 20 мин после 30-кратного введения мексидола

 

Выводы

Однократное воздействие ГГ максимальной интенсивности приводит к гиперкоагуляции в системе гемостаза.

Предварительное 30-кратное введение мексидола (50 мг/кг) перед воздействием ГГ максимальной интенсивности устраняет состояние гиперкоагуляционного сдвига в системе ге­мостаза.

Мексидол повышает резистентность организма к воздействию экстремальных факторов и кис­лородзависимым патологическим сос­тояниям.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Светлана Валерьевна Москаленко

Алтайский государственный медицинский университет; НИИ физиологии и фундаментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: sunrisemsv@gmail.com
г. Барнаул, Россия; г. Новосибирск, Россия

Игорь Ильич Шахматов

Алтайский государственный медицинский университет; НИИ физиологии и фундаментальной медицины

Email: sunrisemsv@gmail.com
г. Барнаул, Россия; г. Новосибирск, Россия

Юлия Алексеевна Бондарчук

Алтайский государственный медицинский университет; НИИ физиологии и фундаментальной медицины

Email: sunrisemsv@gmail.com
г. Барнаул, Россия; г. Новосибирск, Россия

Ольга Васильевна Алексеева

Алтайский государственный медицинский университет; НИИ физиологии и фундаментальной медицины

Email: sunrisemsv@gmail.com
г. Барнаул, Россия; г. Новосибирск, Россия

Оксана Михайловна Улитина

Алтайский государственный медицинский университет; НИИ физиологии и фундаментальной медицины

Email: sunrisemsv@gmail.com
г. Барнаул, Россия; г. Новосибирск, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы