Модуль RRE-REV не оказывает влияния на эффективность упаковки белков cas9 и Gag в вирусоподобные частицы системы Nanomedic

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Доставка рибонуклеопротеиновых комплексов нуклеазы Cas9 и гидовой РНК в клетки-мишени в формате вирусоподобных частиц (VLP, virus-like particles) – один новых методов геномного редактирования, в перспективе пригодный для генной терапии заболеваний человека. Эффективность редактирования генома с помощью VLP зависит от упаковки в них нуклеазы Cas9, что опосредуется вирусным белком Gag. Для улучшения упаковки Cas9 в VLP системы NanoMEDIC плазмидные конструкции для экспрессии Cas9 и Gag были модифицированы добавлением элемента RRE (Rev response element) вируса ВИЧ, который должен повышать экспорт RRE-содержащих транскриптов из ядра в цитоплазму за счет акцессорного белка Rev, как описано для системы VLP на основе Vpr-Cas9. Было установлено, что уровни белков Cas9 и Gag в лизатах клеток повышаются при котрансфекции как плазмиды для экспрессии Rev, так и контрольной пустой плазмиды, и этот эффект не зависит от наличия RRE-элемента в транскрипте. Кроме того, установлено, что основную роль при упаковке Cas9 в частицы системы NanoMEDIC играет AP21967-индуцированная димеризация FRB и FKBP12, но не модификация плазмид с помощью элемента RRE и/или котрансфекция плазмиды, экспрессирующей Rev. Полученные результаты указывают на нецелесообразность использования RRE-Rev модуля для улучшения упаковки нуклеазы Cas9 в VLP.

Ключевые слова

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Н. А. Круглова

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, Москва

Д. С. Комков

Институт биологии гена Российской академии наук; Ben-Gurion University of the Negev

Email: mshepelev@mail.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences

Россия, Москва; Израиль, Be’erSheva

Д. В. Мазуров

Институт биологии гена Российской академии наук; University of Minnesota

Email: mshepelev@mail.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine

Россия, Москва; USA, Minneapolis

М. В. Шепелев

Институт биологии гена Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: mshepelev@mail.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Doudna J.A. // Nature. 2020. V. 578. № 7794. P. 229–236.
  2. Lino C.A., Harper J.C., Carney J.P., Timlin J.A. // Drug Deliv. 2018. V. 25. № 1. P. 1234–1257.
  3. Mazurov D., Ramadan L., Kruglova N. // Viruses. 2023. V. 15. № 3. P. 690.
  4. Banskota S., Raguram A., Suh S., Du S.W., Davis J.R., Choi E.H., Wang X., Nielsen S.C., Newby G.A., Randolph P.B., et al. // Cell. 2022. V. 185. № 2. P. 250-265.e16.
  5. Gee P., Lung M.S.Y., Okuzaki Y., Sasakawa N., Iguchi T., Makita Y., Hozumi H., Miura Y., Yang L.F., Iwasaki M., et al. // Nat Commun. 2020. V. 11. № 1. P. 1334.
  6. Mangeot P.E., Risson V., Fusil F., Marnef A., Laurent E., Blin J., Mournetas V., Massouridès E., Sohier T.J.M., Corbin A., et al. // Nat Commun. 2019. V. 10. № 1. P. 45.
  7. Hamilton J.R., Tsuchida C.A., Nguyen D.N., Shy B.R., McGarrigle E.R., Sandoval Espinoza C.R., Carr D., Blaeschke F., Marson A., Doudna J.A. // Cell Rep. 2021. V. 35. № 9. P. 109207.
  8. Montagna C., Petris G., Casini A., Maule G., Franceschini G.M., Zanella I., Conti L., Arnoldi F., Burrone O.R., Zentilin L., et al. // Mol Ther Nucleic Acids. 2018. V. 12. P. 453–462.
  9. Fernandes J., Jayaraman B., Frankel A. // RNA Biol. 2012. V. 9. № 1. P. 6–11.
  10. Pocock G. M., Becker J.T., Swanson C.M., Ahlquist P., Sherer N.M. // PLoS Pathog. 2016. V. 12. № 4. P. e1005565.
  11. Indikova I., Indik S. // Nucleic Acids Res. 2020. V. 48. № 14. P. 8178–8187.
  12. Mazurov D., Ilinskaya A., Heidecker G., Lloyd P., Derse D. // PLoS Pathog. 2010. V. 6. № 2. P. e1000788.
  13. Dull T., Zufferey R., Kelly M., Mandel R.J., Nguyen M., Trono D., Naldini L. // J Virol. 1998. V. 72. № 11. P. 8463–8471.
  14. Stewart S.A., Dykxhoorn D.M., Palliser D., Mizuno H., Yu E.Y., An D.S., Sabatini D.M., Chen I.S.Y., Hahn W.C., Sharp P.A., et al. // RNA. 2003. V. 9. № 4. P. 493–501.
  15. Han X., Liu Z., Ma Y., Zhang K., Qin L. // Adv Biosyst. 2017. V. 1. № 1–2. P. e1600007.
  16. Hu Q., Suzuki K., Hirschler-Laszkiewicz I., Rothblum L.I. // Biotechniques. 2002. V. 33. № 1. P. 74, 76, 78 passim.
  17. Stepanenko A.A., Heng H.H. // Mutat Res Rev Mutat Res. 2017. V. 773. P. 91–103.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схемы плазмидных конструкций для получения VLP системы NanoMEDIC. Плазмиды pHLS-EF1α-FRB-SpCas9-A и pHLS-EF1α-FKBP12-Gag(HIV) модифицировали путем добавления элемента RRE вируса ВИЧ-1 (RRE) между кодирующей последовательностью (FRB-Cas9 или FKBP12-Gag) и сигналом полиаденилирования (pA). EF1α – промотор гена EEF1A1 человека.

Скачать (92KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Влияние экспрессии белка Rev на уровень продукции FRB-Cas9 и FKPB12-Gag. Лизаты клеток HEK293T, трансфицированных плазмидами для экспрессии FRB-Cas9 и FKPB12-Gag c элементами RRE (RRE+) или без таковых (RRE-) вместе с плазмидой для экспрессии белка Rev (Rev+) или контрольной плазмидой pBluescriptSKII(-) (Rev-), анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к HA-эпитопу (FRB-Cas9), белку ВИЧ p27 (FKBP12-Gag) и α-тубулину для контроля суммарного уровня белка в лизатах клеток. Показаны результаты одного из двух репрезентативных экспериментов.

Скачать (64KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Оценка специфичности эффекта от экспрессии белка Rev на уровень продукции FRB-Cas9. Лизаты клеток HEK293T, трансфицированных плазмидами для экспрессии FRB-Cas9 c элементами RRE или без таковых (RRE-) вместе с плазмидами (а) для экспрессии белков Rev и Eyfp или контрольными плазмидами pBluescriptSKII(-) (pBl) и pCMV-pA (CMV), или (б) для экспрессии белка Rev, его укороченной формы (Rev∆B), плазмиды с делецией N-концевой части кДНК Rev (Rev∆BP) и контрольной плазмиды (pBl) анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к HA-эпитопу (FRB-Cas9) и α-тубулину для контроля суммарного уровня белка в лизатах клеток. Показаны результаты одного из двух репрезентативных экспериментов.

Скачать (95KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Влияние RRE-элементов на упаковку нуклеазы Cas9 в VLP системы NanoMEDIC. VLP получали, как описано в тексте, используя плазмиды для экспрессии FRB-Cas9 и FKPB12-Gag c элементами RRE или без таковых в присутствии белка Rev (Rev+) или без белка Rev (Rev-). Для индукции димеризации FRB и FKBP12 клетки обрабатывали веществом AP21967 в концентрации 300 нМ (AP+) или ДМСО (AP-). Через 48 ч после трансфекции получали лизаты VLP и клеток-продуцентов и анализировали их с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к HA- эпитопу (FRB-Cas9), белку ВИЧ p17 (FKBP12-Gag) и α-тубулину для контроля суммарного уровня белка в лизатах клеток. Показаны результаты одного из двух репрезентативных экспериментов.

Скачать (79KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024