Влияние ДНК-связывающих белков на ферментативную активность терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы в системах с гомополимерными субстратами

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Проведено исследование влияния ДНК-связывающих белков EcSSB и Sso7d, стабилизирующих одноцепочечную и двуцепочечную ДНК соответственно, на активность терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) in vitro. В качестве субстрата использовали гомополимеры Tn, не склонные к образованию вторичных структур. Внесение в реакционную смесь EcSSB приводило к существенному повышению активности TdT и смещению спектра образующихся продуктов в сторону более протяженных олигонуклеотидов, а максимальный эффект наблюдался в близком к эквимолярному стехиометрическом соотношении (EcSSB)4:TdT в присутствии катионов Mn2+. Присутствие Sso7d в реакционной смеси приводило к небольшому (до 15٪) снижению активности TdT для субстратов T5 и T15 и более выраженному для T35 (до 30٪). При этом катионы Co2+ снижали ингибирующий эффект Sso7d. Продемонстрированное в данной работе влияние ДНК-связывающих белков на активность TdT, а также установленные закономерности, могут найти применение как в белковой инженерии при создании гибридных мультидоменных белков на основе TdT, так и при разработке новых принципов ферментативного de novo синтеза ДНК.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. Б. Саченко

Институт биоорганической химии Национальной Академии наук Беларуси

Email: yantsevich@iboch.by
Белоруссия, Минск, 220141

В. В. Щур

Институт биоорганической химии Национальной Академии наук Беларуси

Email: yantsevich@iboch.by
Белоруссия, Минск, 220141

С. А. Усанов

Институт биоорганической химии Национальной Академии наук Беларуси

Email: yantsevich@iboch.by
Белоруссия, Минск, 220141

А. В. Янцевич

Институт биоорганической химии Национальной Академии наук Беларуси

Автор, ответственный за переписку.
Email: yantsevich@iboch.by
Белоруссия, Минск, 220141

Список литературы

  1. Hoose A., Vellacott R., Storch M., Freemont P.S., Ryadnov M.G. // Nat. Rev. Chem. 2023. V. 7. P. 144–161.
  2. Stemmer W.P., Crameri A., Ha K.D., Brennan T.M., Heyneker H.L. // Gene. 1995. V. 164. P. 49–53.
  3. Ma S., Saaem I., Tian J. // Trends Biotechnol. 2012. V. 30. P. 147–154.
  4. Kosuri S., Church G.M. // Nat. Meth. 2014. V. 11. P. 499–507.
  5. Grosse F., Manns A. // Meth. Mol. Biol. 1993. V. 16. P. 95–105.
  6. Bollum F.J. // J. Biol. Chem. 1960. V. 235. P. 2399–2403.
  7. Church G.M., Gao Y., Kosuri S. // Science. 2012. V. 337. P. 1628. https://doi.org/10.1126/science.1226355
  8. Verardo D., Adelizzi B., Rodriguez-Pinzon D.A., Moghaddam N., Thomee E., Loman T. et al. // Science. Adv. 2023. V. 9. P. eadi0263. https://doi.org/10.1126/sciadv.adi0263
  9. Deibel M.R., Jr., Coleman M.S. // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 4206–4212.
  10. Sachanka A.B., Trawkina M., Shchur V.V., Usanov S.A., Yantsevich A.V. // Proc. Nat. Acad. Sci. Bel. Chem. Ser. 2023. V. 55. P. 225–233.
  11. Steitz T.A., Steitz J.A. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 6498–6502.
  12. Barthel S., Palluk S., Hillson N.J., Keasling J.D., Arlow D.H. // Genes. 2020. V. 11. https://doi.org/10.3390/genes11010102
  13. Wang Y., Prosen D.E., Mei L., Sullivan J.C., Finney M., Vander Horn P.B. // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 1197–1207.
  14. Dolgova A.S., Stukolova O.A. // 3 Biotech. 2017. V. 7. P. 128. https://doi.org/10.1007/s13205-017-0745-2
  15. Baumann H., Knapp S., Lundbäck T., Ladenstein R., Härd T. //Nat. Mol. Biol. 1994. V. 1. P. 808–819.
  16. Shehi E., Serina S., Fumagalli G., Vanoni M., Consonni R., Zetta L. et al // FEBS Lett. 2001. V. 497. P. 131–136.
  17. Guagliardi A., Napoli A., Rossi M., Ciaramella M. // J. Mol. Biol. 1997. V. 267. P. 841–848.
  18. McAfee J.G., Edmondson S.P., Datta P.K., Shriver J.W., Gupta R. // Biochem. 1995. V. 34. P. 10063–10077.
  19. Bujalowski W., Overman L.B., Lohman T.M. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 4629–4640.
  20. Bochkarev A., Bochkareva E., Frappier L., Edwards A.M. // EMBO J. 1999. V. 18. P. 4498–4504.
  21. Chédin F., Seitz E.M., Kowalczykowski S.C. // Trends Biochem. Sci. 1998. V. 23. P. 273–277.
  22. Schwarz K., Hansen-Hagge T., Bartram C. // Nucleic Acids res. 1990. V. 18. P. 1079. https://doi.org/10.1093/nar/18.4.1079
  23. Ronaghi M. // Anal. Biochem. 2000. V. 286. P. 282–288.
  24. Yantsevich A.V., Shchur V.V., Usanov S.A. // SLAS tech. 2019. V. 24. № 6. P. 556–568. https://doi.org/10.1177/2472630319850534
  25. Yantsevich A.V., Dzichenka Y.V., Ivanchik A.V., Shapiro M.A., Trawkina M., Shkel T.V., et al.. // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 2017. V. 53. № 2. P. 173–187.
  26. Shlyakhtenko L.S., Lushnikov A.Y., Miyagi A., Lyubchenko Y.L. // Biochem. 2012. V. 51. P. 1500–1509.
  27. Kuffel A., Gray A., Daeid N.N. // Int. J. Leg. Med. 2021. V. 135. P. 63–72.
  28. Johns D., Richard Morgan A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 72. P. 840–849.
  29. Kato K.I., Goncalves J.M., Houts G.E., Bollum F.J. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 2780–2789.
  30. Flamme M., Hanlon S., Iding H., Puentener K., Sladojevich F., Hollenstein M. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2021. V. 48. P. 128242. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2021.128242
  31. Aleksandra A.K., Timofey E.T., Irina V.A., Nadezhda A.T., Olga S.F., Nikita A.K. // Life Sci. All. 2022. V. 5. P. e202201428. https://doi.org/10.26508/lsa.202201428
  32. Kuznetsov S.V., Kozlov A.G., Lohman T.M., Ansari A. // J. Mol. Biol. 2006. V. 359. P. 55–65.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Результаты ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях образцов выделенных рекомбинантных белков TdT (дорожка 1), Sso7d (дорожка 2) и EcSSB (дорожка 3); М – стандарт молекулярных масс белков 10–250 кДа.

Скачать (104KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Результаты электрофореза кольцевой плазмидной ДНК (5994 п.о.) в 1% агарозном геле без Sso7d (дорожка 1), в присутствии Sso7d (дорожка 2). М – стандарт линейной ДНК (а); количество гомополимерных 15-мерных олигонуклеотидов различной природы (нмоль), связавшихся с EcSSB (10 нмоль), иммобилизованном на Ni2+-NTA-агарозе (б).

Скачать (64KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Зависимость активности TdT от длины олигонуклеотидного субстрата в серии гомополимеров Tn.

Скачать (70KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Хроматограммы продуктов элонгации субстратов различной длины (T5–Т50) с участием TdT (конц. ТТР 200 мкМ, время реакции 30 мин): время удерживания, соответствующее субстратам: Т5 – 5.6 мин; Т15 – 12.4 мин; Т25 – 15.2; Т30 – 16.5 мин; Т45 – 18.1 мин; Т50 – 22.2 мин.

Скачать (94KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Влияние катионов Me2+ на ферментативную активность TdT.

Скачать (75KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Зависимость суммарной площади хроматографических пиков продуктов (S) от количества присоединенных TdT нуклеотидов к субстратам T5 и T15 в реакционной смеси, содержащей: 40 нМ TdT, 0.2 мМ TTP, 5 мM AcOK, 2 мM AcOTрис (pH 7.9), 1 мM AcOMg, 0.25 мМ Me2+ (обозначено на легенде для T15), 0.4 мкМ олигонуклеотида (а) и реакционной смеси, дополнительно содержащей 2 мкМ EcSSB (б).

Скачать (259KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Хроматограммы продуктов реакции при различных стехиометрических соотношениях EcSSB/TdT (субстрат T5, tR 5.6 мин, а) и EcSSB/TdT (субстрат T15, tR 12.4 мин, б); контроль: 0.2 мМ TTP, 5 мM AcOK, 2 мM AcOTрис (pH 7.9), 1 мM AcOMg и 0.4 мкМ олигонуклеотида Т5.

Скачать (371KB)
Метаданные
9. Рис. 8. Влияние EcSSB на активность TdT для субстратов различной длины (EcSSB/TdT 5 : 1).

Скачать (95KB)
Метаданные
10. Рис. 9. Влияние белка EcSSB на ферментативную активность TdT в присутствии Me2+: контроль: 40 нМ TdT, 0.2 мМ TTP, 5 мM AcOK, 2 мM AcOTрис (pH 7.9), 1 мM AcOMg, 0.4 мкМ олигонуклеотида Т15 и 2 мкМ EcSSB.

Скачать (78KB)
Метаданные
11. Рис. 10. Хроматограммы продуктов элонгации T15 (tR 12.4 мин), отражающие влияние катионов Me2+ и EcSSB: контроль: 40 нМ TdT, 0.2 мМ TTP, 5 мM AcOK, 2 мM AcOTрис (pH 7.9), 1 мM AcOMg, 0.25 мМ Me2+, 0.4 мкМ Т15 и 2 мкМ EcSSB.

Скачать (206KB)
Метаданные
12. Рис. 11. Влияние Sso7d на активность TdT в реакции элонгации T5, T15, T35 в различных условиях. Отражено влияние катионов Zn2+ и Co2+ на элонгацию T15.

Скачать (118KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024