


Том 54, № 1 (2023)
ОБЗОРЫ
Серотонин и надпочечники: регуляция функций, регуляция развития
Аннотация
Серотонин является не только нейротрансмиттером, но и важным гуморальным регулятором разнообразных физиологических процессов за пределами центральной нервной системы. В последнее десятилетие складывается концепция существования локальных серотонинергических систем в периферических органах, где серотонин реализует свое воздействие через аутокринно-паракринные механизмы. Такие локальные системы уже описаны в поджелудочной железе, тимусе, молочной железе, красном костном мозге. Мы считаем, что подобная локальная серотонинергическая система характерна и для надпочечников. Эти парные органы являются ключевым компонентом эндокринной системы млекопитающих, обеспечивающим комплексную физиологическую реакцию на стресс. Надпочечники состоят из двух неродственных по происхождению и функциям отделов – коры и медуллы, при этом серотонин играет важную роль в регуляции секреции гормонов в обеих этих структурах. Цель данного обзора – анализ структуры локальной серотонинергической системы в надпочечнике, а также ее роли как в регуляции функций надпочечников у взрослых животных, так и в их формировании в эмбриогенезе. Обобщение имеющихся данных позволяет говорить о том, что наличие локальной серотонинергической системы делает орган восприимчивым к колебаниям уровня циркулирующего в крови серотонина на всех этапах онтогенеза. Таким образом, локальная чувствительность к серотонину обеспечивает возможность системной гуморальной координации формирования и функционирования как надпочечников, так и других периферических органов. В этом аспекте становится понятна важность локальных серотонинергических систем для медицины и биологии развития.



ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Функционирование ядрышкового организатора в растущих ооцитах кур: ревизия существующих представлений
Аннотация
В современной литературе утвердилось представление о том, что в яичнике взрослых самок птиц ядрышковый организатор (ЯОР) инактивирован на всех стадиях роста ооцита. Однако на примере яичника цыплят Gallus g. domesticus, в половине ооцитов стадии ранней диплотены обнаруживали одно или два ядрышка, которые функционировали вплоть до стадии развитых ламповых щеток. Предполагалось, что диплотенные ооциты с инактивированным ЯОР у цыпленка сохраняются как резерв для развития в яичнике взрослой самки. Такое несоответствие в функциональной активности ЯОР в ооцитах цыпленка и взрослой самки требовало специальных исследований. Здесь мы приводим новые результаты сравнительного анализа ядрышка в ооцитах у цыплят и у половозрелых кур. Мы впервые показываем, что в ооцитах взрослых кур, как и у цыплят, ядрышко появляется на стадии ранней диплотены и синтез пре-рРНК в нем продолжается до стадии ламповых щеток. На стадии ламповых щеток ЯОР инактивируется: ядрышко распадается на крупные фрагменты, содержащие как пре-рРНК, так и фибрилларин, а затем на мелкие гранулы, которые не содержат пре-рРНК, но содержат фибрилларин. Результаты устраняют указанное выше противоречие и демонстрируют сходный алгоритм функционирования ЯОР в ооцитах у половозрелых и неполовозрелых самок птиц.



Получение качественного препарата РНК и оценка референсных генов для постановки количественной ПЦР при работе с тканями ствола Pinus sylvestris L.
Аннотация
Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) относится к видам древесных растений, для которых характерно наличие ядровой древесины (HW), формирующейся в ходе старения заболони (SW). Благодаря четкой границе между SW и HW P. sylvestris может служить модельным древесным растением для изучения закономерностей формирования HW. В настоящее время для изучения процессов формирования тканей ствола древесных растений активно применяются молекулярно-генетические методы. Особенностью тканей ствола хвойных древесных растений является содержание большого количества вторичных метаболитов, низкое содержание нуклеиновых кислот и возможная частичная деградация РНК. В данной работе рассматривается выбор наиболее успешного метода выделения высококачественного препарата РНК для проведения ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в тканях ствола P. sylvestris по радиальному вектору “проводящая флоэма/камбиальная зона – дифференцирующаяся ксилема – внешняя часть SW (1–2 годичных кольца) – внутренняя часть SW (1–2 кольца перед транзитной зоной (TZ)) – TZ (2 кольца перед HW)” для получения воспроизводимых данных ПЦР-РВ. Во всех описанных тканях проведена оценка стабильности экспрессии шести потенциальных референсных генов (Actin1, α-Tubulin, β-Tubulin, Ef1a, GAPDH, UBQ). Показаны различия в уровнях экспрессии целевых генов при нормализации данных с использованием референсных генов с различной стабильностью экспрессии.



Роль компонентов внеклеточного матрикса в дифференцировке эктодермальных производных плюрипотентных клеток человека
Аннотация
Одним из важнейших событий эмбрионального развития млекопитающих является разделение эктодермы на покровную и нейроэктодерму. Сигнальные каскады, индуцируемые факторами роста и цитокинами, вовлеченными в эти процессы, детально изучаются последние десятилетия. В то же время вклад компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) в эти направления дифференцировки остается неизвестным для млекопитающих, в то время как важнейшая роль ВКМ в этом процессе показана на других модельных организмах. Для оценки влияния компонентов ВКМ на формирование эктодермальных производных мы моделировали нейральную и эпидермальную дифференцировку индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека с использованием субстратов, состоящих из различных компонентов ВКМ, а также исследовали вовлеченность в процессы дифференцировки одного из центральных звеньев сигнальных каскадов ВКМ, транскрипционного коактиватора YAP1. Наши результаты выявили стимулирующий эффект ламинина 332 на ранние этапы эпидермальной дифференцировки и коллагенов I и III типов на выделение глиального направления поздней нейральной дифференцировки.



Моделирование децидуализации клеток стромы эндометрия мыши с последующей имплантацией эмбриона in vitro
Аннотация
Децидуализация клеток стромы – ключевой этап приобретения рецептивности эндометрия к эмбриону. Этот процесс регулируется половыми стероидными гормонами, а у мыши дополнительно индуцируется прикреплением эмбриона. В настоящее время существует множество протоколов индукции децидуализации стромы in vitro, однако большинство из них требует проверки соответствия процессов, происходящих в культуре клеток, таковым в живом организме. Эта работа посвящена изучению морфологии клеток стромы и экспрессионной активности генов, ответственных за прогрессирование децидуализации в 2D культуре с последующим прикреплением эмбриона. Также исследована целесообразность использования нескольких вариантов протоколов индукции децидуализации и возможность применения клеток стромы после криоконсервации.



КОЛЛЕКЦИЯ ЛИНИЙ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Создание линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ICGi043-A с помощью репрограммирования мононуклеарных клеток периферической крови пациента с болезнью Паркинсона, ассоциированной с патологическим вариантом p.G2019S LRRK2
Аннотация
Патологический вариант p.G2019S в гене LRRK2 приводит к возникновению наследственной формы болезни Паркинсона (БП) и встречается у 7% пациентов с семейной формой данной патологии, однако пока до конца не ясны механизмы, запускающие нейродегенеративные процессы. Из мононуклеарных клеток периферической крови пациента с наследственной формой БП, ассоциированной с генетическим вариантом c.6055G>A (p.G2019S, rs34637584) в гене LRRK2 нами были получены ИПСК (линия iCGi043-A) с использованием трансфекции эписомными векторами. Данные ИПСК интенсивно пролиферируют плотными однослойными колониями клеток, являются позитивными на эндогенную щелочную фосфатазу, имеют нормальный кариотип (46,XX), экспрессируют маркеры плюрипотентности (OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60, SSEA-4) и способны дифференцироваться в три зародышевых листка (экто-, энто- и мезодерму), что подтверждает их плюрипотентный статус. Дальнейшая направленная дифференцировка полученных ИПСК в дофаминергические нейроны позволит создать in vitro клеточную модель БП, ассоциированную с патологическим вариантом c.6055G>A в гене LRRK2 и внести вклад в понимание патогенеза БП.



Создание линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ICGi042-A с помощью репрограммирования мононуклеарных клеток периферической крови пациента с болезнью Паркинсона, ассоциированной с генетическим вариантом c.1000G>A в гене LRRK2
Аннотация
Поиск новых полиморфизмов, связанных с наследственными заболеваниями, важен для диагностики и изучения патологии развития болезни. Мы проанализировали клинический экзом пациента с болезнью Паркинсона и выявили полиморфизмы в генах LRRK2 (c.1000G>A, c.2167A>G) и PINK1 (c.1562A>C). Генетический вариант LRRK2:c.1000G>A имеет неопределенное клиническое значение и представляет интерес для дальнейшего изучения. Мы создали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из мононуклеарных клеток периферической крови пациента с помощью неинтегрирующихся эписомных векторов. ИПСК (линия ICGi042-A) демонстрируют типичную морфологию и нормальный кариотип (46,XY), экспрессируют маркеры плюрипотентности (OCT4, SOX2, NANOG, SSEA4, TRA-1-60) и способны продуцировать производные трех зародышевых листков.



Линия индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ICGi023-A, полученная от пациента с полиморфизмами в генах LRRK2 и PINK1, ассоциированными с болезнью Паркинсона
Аннотация
Болезнь Паркинсона – это нейродегенеративное заболевание, лишь в 5% случаев имеющее известную генетическую обусловленность. Анализ клинического экзома пациента со случаями паркинсонизма в семейном анамнезе выявил полиморфизмы в генах LRRK2 и PINK1. Мононуклеарные клетки крови пациента репрограммированы к плюрипотентному состоянию с помощью эписомных векторов, экспрессирующих факторы плюрипотентности. Линия индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) демонстрировала типичную морфологию плюрипотентных клеток человека, имела нормальный кариотип, экспрессировала OCT4, NANOG, SOX2 и TRA-1-60 и давала производные трех зародышевых листков при спонтанной дифференцировке in vitro. Полученная линия ИПСК является ценным инструментом для изучения вклада полиморфных вариантов генов LRRK2 и PINK1 в патогенез болезни Паркинсона.



Получение линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ICGi022-A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5 с внесенной в ген MYBPC3 с помощью системы CRISPR/Cas9 мутацией p.Asn515del
Аннотация
До 60% случаев гипертрофической кардиомиопатии обусловлены мутациями в генах, отвечающих за функционирование саркомеров. Однако не для всех вариантов, обнаруженных в ассоциированных с гипертрофической кардиомиопатией генах, в настоящее время известно их клиническое значение. Новые возможности для выяснения клинического значения генетических вариантов открывает использование методов редактирования нуклеотидных последовательностей. Трехнуклеотидная делеция c.1543_1545delAAC (p.Asn515del) с неясным клиническим значением была внесена в ген MYBPC3 индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) здорового донора с помощью системы CRISPR/Cas9. В результате были получены три линии ИПСК (ICGi022-A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5), гомозиготные по данной мутации. Линии ИПСК с внесенной делецией имели характерную для плюрипотентных клеток человека морфологию, нормальный кариотип (46,XX), экспрессировали маркеры плюрипотентного состояния (OCT4, NANOG, TRA-1-60, SSEA-4) и были способны давать производные трех зародышевых листков при спонтанной дифференцировке. Исследование свойств кардиомиоцитов, полученных при направленной дифференцировке линий ИПСК ICGi022-A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5, позволит установить патогенетический вклад варианта p.Asn515del в гене MYBPC3 в развитие гипертрофической кардиомиопатии.



Создание линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ICGi044-B и ICGi044-C с помощью репрограммирования мононуклеарных клеток периферической крови пациента с болезнью Паркинсона, ассоциированной с мутацией с.1492T>G в гене GLUD2
Аннотация
Болезнь Паркинсона – мультифакториальное заболевание, в его этиологию вносят вклад как генетическая предрасположенность (5% всех случаев), так и факторы окружающей среды, и возрастные изменения в головном мозге и других системах организма. Для диагностики и изучения патологии развития болезни важен поиск новых полиморфизмов, ассоциированных с наследственными формами заболевания. Мы проанализировали клинический экзом 55-летнего пациента с болезнью Паркинсона и выявили полиморфизм в гене GLUD2 (c.1492T>G). Данный полиморфизм является патогенным по базе данных ClinVar, однако механизм патогенеза до сих пор остается мало изученным. Кроме того, в настоящее время нет релевантных моделей на основе клеток человека, что вызывает большой интерес. Мы создали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из мононуклеарных клеток периферической крови пациента с помощью неинтегрирующихся эписомных векторов (OCT4, KLF4, L-MYC, SOX2, LIN28 и p53 shRNA). Полученные линии ИПСК (ICGi044-B и ICGi044-C) демонстрируют типичную ЭСК-подобную морфологию, нормальный кариотип (46,XY), экспрессируют маркеры плюрипотентности (OCT4, SOX2, NANOG, SSEA4, TRA-1-60) и способны давать производные трех зародышевых листков. Линии ИПСК ICGi044-B и ICGi044-C, а также их нейральные производные представляют собой уникальную клеточную модель in vitro для изучения патогенетических механизмов развития болезни Паркинсона, ассоциированной с мутацией c.1492T>G в гене GLUD2.


