Подход для анализа внутриклеточных маркеров в фосфатидилсерин-положительных тромбоцитах

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Фосфатидилсерин (ФС)-положительные тромбоциты играют важную роль в тромбозе и гемостазе. Они имеют высокую прокоагулянтную активность, способность к везикуляции и могут агрегировать с активированными ФС-отрицательными тромбоцитами. Они обнаруживаются в растущем тромбе in vitro, однако остается ряд загадок, связанных с ними. В частности, внутриклеточная сигнализация и реорганизация цитоскелета в этих тромбоцитах исследованы очень слабо, поскольку они разрушаются при пермеабилизации, необходимой для проникновения антител к внутриклеточным маркерам. В данной работе мы предлагаем подход, который позволяет анализировать внутриклеточные маркеры в индуцированных кальциевым ионофором А23187 ФС-положительных тромбоцитах с помощью проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. Мы использовали наиболее мягкую пермеабилизацию фиксированных ФС-положительных тромбоцитов с помощью сапонина и показали, что такая пермеабилизация позволяет в значительной мере сохранить ФС-положительные тромбоциты. Для примера мы проанализировали состояние полимеризованной формы актина в ФС-положительных тромбоцитах и показали, что несмотря на значительную перестройку цитоскелета, происходящую при активации в таких тромбоцитах, актин в них частично представлен в полимеризованной форме.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Е. О. Артеменко

Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН; Национальный медицинский исследовательский центр детской онкологии, гематологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева

Автор, ответственный за переписку.
Email: lartemenko@yandex.ru
Россия, Москва, 109029; Москва, 117997

С. И. Обыденный

Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН; Национальный медицинский исследовательский центр детской онкологии, гематологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева

Email: lartemenko@yandex.ru
Россия, Москва, 109029; Москва, 117997

М. А. Пантелеев

Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН; Национальный медицинский исследовательский центр детской онкологии, гематологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: lartemenko@yandex.ru

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, физический факультет

Россия, Москва, 109029; Москва, 117997; Москва, 119991

Список литературы

  1. Bevers E.M., Tilly R.H., Senden J.M., Comfurius P., Zwaal R.F. 1989. Exposure of endogenous phosphatidylserine at the outer surface of stimulated platelets is reversed by restoration of aminophospholipid translocase activity. Biochemistry. 28 (6), 2382–2387. doi: 10.1021/bi00432a007
  2. Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. 2008. Formation of coated platelets is regulated by the dense granule secretion of adenosine 5'diphosphate acting via the P2Y12 receptor. J. Thromb. Haemost. 6 (9), 1603–1605. doi: 10.1111/j.1538-7836.2008.03052.x
  3. Podoplelova N.A., Nechipurenko D.Y., Ignatova A.A., Sveshnikova A.N., Panteleev M.A. 2021. Procoagulant platelets: Mechanisms of generation and action. Hamostaseologie. 41 (2), 146–153. doi: 10.1055/a-1401-2706
  4. Dale G.L. 2005. Coated-platelets: An emerging component of the procoagulant response. J. Thromb. Haemost. 3 (10), 2185–2192. doi: 10.1111/j.1538-7836.2005.01274.x
  5. Sinauridze E.I., Kireev D.A., Popenko N.Y., Pichugin A.V., Panteleev M.A., Krymskaya O.V., Ataullakhanov F.I. 2007. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb. Haemost. 97 (3), 425–434.
  6. Yakimenko A.O., Verholomova F.Y., Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. 2012. Identification of different proaggregatory abilities of activated platelet subpopulations. Biophys. J. 102 (10), 2261–2269. doi: 10.1016/j.bpj.2012.04.004.
  7. Nechipurenko D.Y., Receveur N., Yakimenko A.O., Shepelyuk T.O., Yakusheva A.A., Kerimov R.R., Obydennyy S.I., Eckly A., Léon C., Gachet C., Grishchuk E.L., Ataullakhanov F.I., Mangin P.H., Panteleev M.A. 2019. Clot contraction drives the translocation of procoagulant platelets to thrombus surface. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 39 (1), 37–47. doi: 10.1161/ATVBAHA.118.311390
  8. Gaffet P., Bettache N., Bienvenüe A. 1995. Phosphatidylserine exposure on the platelet plasma membrane during A23187-induced activation is independent of cytoskeleton reorganization. Eur. J. Cell Biol. 67 (4), 336–345.
  9. Verhallen P.F., Bevers E.M., Comfurius P., Zwaal R.F. 1987. Correlation between calpain-mediated cytoskeletal degradation and expression of platelet procoagulant activity. A role for the platelet membrane-skeleton in the regulation of membrane lipid asymmetry? Biochim. Biophys. Acta. 903 (1), 206–217. doi: 10.1016/0005-2736(87)90170-2
  10. Artemenko E.O., Yakimenko A.O., Pichugin A.V., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. 2016. Calpain-controlled detachment of major glycoproteins from the cytoskeleton regulates adhesive properties of activated phosphatidylserine-positive platelets. Biochem. J. 473 (4), 435–448. doi: 10.1042/BJ20150779
  11. Dale G.L., Friese P., Batar P., Hamilton S.F., Reed G.L., Jackson K.W., Clemetson K.J., Alberio L. 2002. Stimulated platelets use serotonin to enhance their retention of procoagulant proteins on the cell surface. Nature. 415 (6868), 175–179. doi: 10.1038/415175a.
  12. Pasquet J.M., Dachary-Prigent J., Nurden A.T. 1998. Microvesicle release is associated with extensive protein tyrosine dephosphorylation in platelets stimulated by A23187 or a mixture of thrombin and collagen. Biochem. J. 333 (Pt 3)(Pt 3), 591–599. doi: 10.1042/bj3330591
  13. Rochat S., Alberio L. 2015. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32–36. doi: 10.1002/cyto.a.22567
  14. Jamur M.C., Oliver C. 2010. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol. Biol. 588, 63–66. doi: 10.1007/978-1-59745-324-0_9

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Проточная цитометрия для неактивированных и активированных А23187 тромбоцитов (н/а – неактивированные, А23187 – активированные ФС-положительные). а–в – Приведены дот-плоты типичных экспериментов (n = 3). Первый столбец показывает FSC – прямое светорассеяние, второй столбец FL4-A – флуоресценция CD61-Алекса Флуор 647, третий столбец FL1-A – флуоресценция фаллоидина-ФИТЦ; SSC – боковое светорассеяние. г – Приведены усредненные данные по трем донорам, количество тромбоцитов без обработки их детергентом взято за 1. д – Приведены относительные значения флуоресценции окрашивания фаллоидином-ФИТЦ фиксированных тромбоцитов после их пермеабилизации (n = 3).

Скачать (2MB)
Метаданные
3. Рис. 2. Исследование структуры ФС-положительных тромбоцитов, полученных активацией ионофором А23187, с помощью конфокальной микроскопии. а – Фиксированные ФС-положительные тромбоциты, пермеабилизованные сапонином, окрашенные CD61-Алекса Флуор 647 и фаллоидином-ФИТЦ. б – Фиксированные ФС-положительные тромбоциты, непермеабилизованные, окрашенные только CD61-Алекса Флуор 647. в – Фиксированные ФС-положительные тромбоциты, пермеабилизованные сапонином, окрашенные только CD61-Алекса Флуор 647. ДИК – дифференциальный интерференционный контраст. Шкала равна 10 мкм.

Скачать (261KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025