Участие белков комплекса CPSF в полиаденилировании транскриптов, считываемых РНК-полимеразой III с SINE

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

SINE – мобильные генетические элементы многоклеточных эукариот, возникавшие в ходе эволюции из различных тРНК, а также из 5S рРНК и 7SL РНК. Подобно генам этих РНК, SINE транскрибируются РНК-полимеразой III. Транскрипты некоторых SINE млекопитающих обладают уникальной для транскриптов РНК-полимеразы III способностью подвергаться AAUAAA-зависимому полиаденилированию. Несмотря на определенное сходство с каноническим полиаденилированием мРНК (транскриптов РНК-полимеразы II), эти процессы имеют, по-видимому, и существенные различия. В данной работе оценена важность белков комплекса CPSF, образованного субкомплексами mPSF и mCF и направляющего полиаденилирование мРНК, для полиаденилирования транскриптов SINE. В клетках HeLa при помощи siРНК проводили нокдаун компонентов CPSF, после чего клетки трансфицировали плазмидными конструкциями, содержащими SINE. Методом нозерн-гибридизации оценивали снижение эффективности полиаденилирования транскриптов SINE в результате нокдауна того или иного белка. Оказалось, что такие компоненты CPSF, как Wdr33 и CPSF30, вносят вклад в полиаденилирование транскриптов SINE, тогда как нокдаун CPSF100, CPSF73 и симплекина не снижает полиаденилирования этих транскриптов. Wdr33 и CPSF30, наряду с исследованными нами ранее CPSF160 и Fip1, входят в состав субкомплекса mPSF, ответственного за полиаденилирование мРНК. Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют о важности всех белков mPSF для полиаденилирования транскриптов SINE. В то же время CPSF100, CPSF73 и симплекин, образующие субкомплекс mCF, ответственны за разрезание пре-мРНК, поэтому их неучастие в полиаденилировании транскриптов SINE представляется вполне естественным.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

И. Г. Устьянцев

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: kramerov@eimb.ru
Россия, Москва, 119991

О. Р. Бородулина

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: kramerov@eimb.ru
Россия, Москва, 119991

Д. А. Крамеров

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: ustian@mail.ru
Россия, Москва, 119991

Список литературы

  1. Устьянцев И.Г., Голубчикова Ю.С., Бородулина О.Р., Крамеров Д.А. (2017) Каноническое и неканоническое полиаденилирование РНК. Молекуляр. биология. 51, 262–273. doi: 10.1134/S0026893317010186
  2. Sun Y., Hamilton K., Tong L. (2020) Recent molecular insights into canonical pre-mRNA 3’-end processing. Transcription. 11, 83–96.
  3. Liu J., Lu X., Zhang S., Yuan L., Sun Y. (2022) Molecular insights into mRNA polyadenylation and deadenylation. Int. J. Mol. Sci. 23, 10985.
  4. Boreikaite V., Passmore L.A. (2023) 3’-End processing of eukaryotic mRNA: machinery, regulation, and impact on gene expression. Annu. Rev. Biochem. 92, 199–225.
  5. Proudfoot N.J. (2011) Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes Dev. 25, 1770–1782.
  6. Gutierrez P.A., Wei J., Sun Y., Tong L. (2022) Molecular basis for the recognition of the AUUAAA polyadenylation signal by mPSF. RNA. 28, 1534–1541.
  7. Zhang Y., Sun Y., Shi Y., Walz T., Tong L. (2020) Structural insights into the human pre-mRNA 3’-end processing machinery. Mol. Cell. 77, 800–809.e806.
  8. Yang Q., Gilmartin G.M., Doublie S. (2010) Structural basis of UGUA recognition by the Nudix protein CFI(m)25 and implications for a regulatory role in mRNA 3’ processing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10062–10067.
  9. Zhu Y., Wang X., Forouzmand E., Jeong J., Qiao F., Sowd G.A., Engelman A.N., Xie X., Hertel K.J., Shi Y. (2018) Molecular mechanisms for CFIm-mediated regulation of mRNA alternative polyadenylation. Mol. Cell. 69, 62–74.e64.
  10. Sachs A., Wahle E. (1993) Poly(A) tail metabolism and function in eucaryotes. J. Biol. Chem. 268, 22955–22958.
  11. Nicholson A.L., Pasquinelli A.E. (2019) Tales of detailed poly(A) tails. Trends Cell Biol. 29, 191–200.
  12. Neve J., Patel R., Wang Z., Louey A., Furger A.M. (2017) Cleavage and polyadenylation: ending the message expands gene regulation. RNA Biol. 14, 865–890.
  13. Laishram R.S. (2014) Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression – star-PAP vs canonical PAP. FEBS Lett. 588, 2185–2197.
  14. Charlesworth A., Meijer H.A., de Moor C.H. (2013) Specificity factors in cytoplasmic polyadenylation. Wiley Interdiscip. Rev. RNA. 4, 437–461.
  15. Norbury C.J. (2013) Cytoplasmic RNA: a case of the tail wagging the dog. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 643–653.
  16. Татосян К.А., Устьянцев И.Г., Крамеров Д.А. (2020) Деградация РНК в эукариотических клетках. Молекуляр. биология. 54, 542–561. doi: 10.1134/S0026893320040159
  17. Borodulina O.R., Kramerov D.A. (2008) Transcripts synthesized by RNA polymerase III can be polyadenylated in an AAUAAA-dependent manner. RNA. 14, 1865–1873.
  18. Kramerov D.A., Vassetzky N.S. (2011) SINEs. Wiley Interdiscip. Rev. RNA. 2, 772–786.
  19. Kramerov D.A., Vassetzky N.S. (2011) Origin and evolution of SINEs in eukaryotic genomes. Heredity. (Edinb). 107, 487–495.
  20. Vassetzky N.S., Kramerov D.A. (2013) SINEBase: a database and tool for SINE analysis. Nucl. Acids Res. 41, D83‒D89.
  21. Deininger P. (2011) Alu elements: know the SINEs. Genome Biol. 12, 236.
  22. Borodulina O.R., Kramerov D.A. (2001) Short interspersed elements (SINEs) from insectivores. Two classes of mammalian SINEs distinguished by A-rich tail structure. Mamm. Genome. 12, 779–786.
  23. Устьянцев И.Г., Татосян К.А., Стасенко Д.В., Кочанова Н.Ю., Бородулина О.Р., Крамеров Д.А. (2017) Полиаденилирование транскриптов, считываемых РНК-полимеразой III с SINE, значительно удлиняет время их жизни в клетке. Молекуляр. биология. 54, 78–86. doi: 10.1134/S0026893319040150
  24. Borodulina O.R., Ustyantsev I.G., Kramerov D.A. (2023) SINEs as potential expression cassettes: impact of deletions and insertions on polyadenylation and lifetime of B2 and Ves SINE transcripts generated by RNA polymerase III. Int. J. Mol. Sci. 24(19), 14600.
  25. Dewannieux M., Heidmann T. (2005) Role of poly(A) tail length in Alu retrotransposition. Genomics. 86, 378–381.
  26. Vassetzky N.S., Borodulina O.R., Ustyantsev I.G., Kosushkin S.A., Kramerov D.A. (2021) Analysis of SINE families B2, Dip, and Ves with special reference to polyadenylation signals and transcription terminators. Int. J. Mol. Sci. 22(18), 9897.
  27. Kosushkin S.A., Ustyantsev I.G., Borodulina O.R., Vassetzky N.S., Kramerov D.A. (2022) Tail wags dog’s SINE: retropositional mechanisms of can SINE depend on its a-tail structure. Biology (Basel). 11(10), 1403.
  28. Borodulina O.R., Golubchikova J.S., Ustyantsev I.G., Kramerov D.A. (2016) Polyadenylation of RNA transcribed from mammalian SINEs by RNA polymerase III: сomplex requirements for nucleotide sequences. Biochim. Biophys. Acta. 1859, 355–365.
  29. Ustyantsev I.G., Borodulina O.R., Kramerov D.A. (2021) Identification of nucleotide sequences and some proteins involved in polyadenylation of RNA transcribed by Pol III from SINEs. RNA Biol. 18, 1475–1488.
  30. Chomczynski P., Sacchi N. (2006) The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581–585.
  31. Clerici M., Faini M., Muckenfuss L.M., Aebersold R., Jinek M. (2018) Structural basis of AAUAAA polyadenylation signal recognition by the human CPSF complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 25, 135–138.
  32. Sun Y., Zhang Y., Hamilton K., Manley J.L., Shi Y., Walz T., Tong L. (2018) Molecular basis for the recognition of the human AAUAAA polyadenylation signal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 115, E1419–E1428.
  33. Shi Y., Manley J.L. (2015) The end of the message: multiple protein-RNA interactions define the mRNA polyadenylation site. Genes Dev. 29, 889–897.
  34. Ray D., Kazan H., Cook K.B., Weirauch M.T., Najafabadi H.S., Li X., Gueroussov S., Albu M., Zheng H., Yang A., Na H., Irimia M., Matzat L.H., Dale R.K., Smith S.A., Yarosh C.A., Kelly S.M., Nabet B., Mecenas D., Li W., Laishram R.S., Qiao M., Lipshitz H.D., Piano F., Corbett A.H., Carstens R.P., Frey B.J., Anderson R.A., Lynch K.W., Penalva L.O., Lei E.P., Fraser A.G., Blencowe B.J., Morris Q.D., Hughes T.R. (2013) A compendium of RNA-binding motifs for decoding gene regulation. Nature. 499, 172–177.
  35. Mikula M., Bomsztyk K., Goryca K., Chojnowski K., Ostrowski J. (2013) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (HnRNP) K genome-wide binding survey reveals its role in regulating 3’-end RNA processing and transcription termination at the early growth response 1 (EGR1) gene through XRN2 exonuclease. J. Biol. Chem. 288, 24788–24798.
  36. Wang Z., Qiu H., He J., Liu L., Xue W., Fox A., Tickner J., Xu J. (2020) The emerging roles of hnRNPK. J. Cell Physiol. 235, 1995–2008.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок S1. Дополнительные материалы к статье
Скачать (495KB)
Метаданные
3. Рис. 1. Снижение уровня экспрессии белков в результате их нокдауна. a – Детекция белков с помощью вестерн-блотинга. Над дорожками указаны siРНК, которыми обрабатывали клетки HeLa. Снизу приведены названия детектируемых белков: слева – контрольный белок гяРНП E2 с массой 40 кДа, справа – белок, подвергаемый нокдауну. б – Снижение уровня белка в клетках, обработанных специфическими siРНК относительно его уровня в клетках, обработанных контрольной siРНК (сделана поправка на экспрессию контрольного белка, гяРНП E2, в обоих образцах). Проведено не менее трех опытов с нокдауном каждого из белков, показано стандартное отклонение; * и ** – p < 0.05 и < 0.01 соответственно (t-критерий).

Скачать (53KB)
Метаданные
4. Рис. 2. Влияние нокдауна белков на полиаденилирование транскриптов SINE. Нозерн-блот-анализ РНК, выделенных из клеток HeLa, обработанных сначала siРНК (над дорожками указано, какими именно: контрольными (“Контроль”), против CPSF30, Wdr33, симплекина, CPSF100, CPSF73, гяРНП K, CFIm25, CPSF160 или оставшихся необработанными (“Без siРНК”) в течение 72 ч, а затем трансфицированных различными конструкциями на основе SINE Ves, B2 или Ere (их названия указаны под сериями дорожек). Нокдаун CPSF160 или CFIm25 проведен в качестве положительного контроля на снижение полиаденилирования транскриптов. Черными стрелкам помечены первичные транскрипты, а фигурными скобками – полиаденилированные транскрипты; белая стрелка указывает на характерный для Ves укороченный транскрипт, образующийся вследствие терминации транскрипции на неоптимальном терминаторе и не способный к полиаденилированию. Одна из дорожек на правом нижнем блоте – гяРНП K (48) – соответствует опыту, в котором трансфекция плазмидами проведена спустя 48 ч после начала обработки клеток siРНК к гяРНП K. Время обработки сокращено с целью уменьшения цитотоксического действия данных siРНК.

Скачать (76KB)
Метаданные
5. Рис. 3. Диаграммы, иллюстрирующие количественное влияние нокдауна различных белков на полиаденилирование транскриптов конструкций SINE B2, Ves и Ere, содержащих только τ-сигнал (–Δβ), только β-сигнал (–Δτ) или оба сигнала (–T, дикий тип). Показан средний уровень полиаденилирования транскриптов каждой конструкции (названия указаны слева от диаграммы) в клетках, трансфицированных специфическими siРНК, относительно уровня полиаденилирования в клетках, обработанных контрольной siРНК (этот уровень принят за 100% и отмечен вертикальной пунктирной линией). Стандартное отклонение получено по результатам трех опытов; *, ** и *** – p < 0.05, < 0.01 и < 0.001 соответственно (t-критерий). a – Компоненты субкомплекса mPSF: CPSF30 и Wdr33. б – Компоненты субкомплекса mCF: симплекин, CPSF100 и CPSF73. в – Белок гяРНП K.

Скачать (93KB)
Метаданные
6. Рис. 4. Схема полиаденилирования транскрипта SINE, синтезированного РНК-полимеразой III. Названия белков даны курсивом: черным показаны белки, нокдаун которых проведен в нашем предыдущем исследовании [29], красным – белки, экспрессия которых подавлялась в данном исследовании. Субкомплекс mPSF комплекса CPSF взаимодействует с сигналом полиаденилирования AAUAAA за счет субъединиц Wdr33 и CPSF30. Белок Y (CFIm25 в случае SINE B2) связывается с τ-сигналом, стимулируя полиаденилирование, осуществляемое поли(А)-полимеразой (PAP). Предполагается, что гипотетический белок X, связавшись с β-сигналом, также стимулирует полиаденилирование; в случае B2, а также Ves, этим белком может быть гяРНП K. Субкомплекс mCF, ответственный за разрезание пре-мРНК, в полиаденилировании транскрипта SINE не участвует.

Скачать (27KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024