Kazan medical journalKazan medical journalКазанский медицинский журнал0368-48142587-9359Eco-Vector7210510.17816/KMJ2021-501Experimental medicineЭкспериментальная медицинаResearch ArticleComparative characteristics of various fibrous materials in in vitro experimentsСравнительная характеристика различных волокнистых материалов в экспериментах in vitrohttps://orcid.org/0000-0002-2479-2474TimerbulatovaG AТимербулатоваГюзель Абдулхалимовна
Russian Federation
ragura@mail.ruDunaevP DДунаевПавел Дмитриевич
Russian Federation
dunaevpavel@mail.ruDimievA MДимиевАйрат Маратович
Russian Federation
ayrat_dimiev@mail.ruGabidinovaG FГабидиноваГульназ Фаезовна
Russian Federation
gabidinova26@yandex.ruKhaertdinovN NХаертдиновНаиль Назимович
Russian Federation
khaertdinofnn@gmail.comFakhrullinR FФахруллинРавиль Фаридович
Russian Federation
kazanbio@gmail.comBoichukS VБойчукСергей Васильевич
Russian Federation
boichuksergei@mail.ruFatkhutdinovaL MФатхутдиноваЛилия Минвагизовна
Russian Federation
liliya.fatkhutdinova@gmail.comKazan State Medical UniversityКазанский государственный медицинский университетCenter of Hygiene and Epidemiology in the Republic of TatarstanЦентр гигиены и эпидемиологии в Республике ТатарстанKazan Federal UniversityКазанский (Приволжский) федеральный университет0808202110245015092406202122072021Copyright ©; 2021, Timerbulatova G.A., Dunaev P.D., Dimiev A.M., Gabidinova G.F., Khaertdinov N.N., Fakhrullin R.F., Boichuk S.V., Fatkhutdinova L.M.Copyright ©; 2021, Тимербулатова Г.А., Дунаев П.Д., Димиев А.М., Габидинова Г.Ф., Хаертдинов Н.Н., Фахруллин Р.Ф., Бойчук С.В., Фатхутдинова Л.М.2021Timerbulatova G.A., Dunaev P.D., Dimiev A.M., Gabidinova G.F., Khaertdinov N.N., Fakhrullin R.F., Boichuk S.V., Fatkhutdinova L.M.Тимербулатова Г.А., Дунаев П.Д., Димиев А.М., Габидинова Г.Ф., Хаертдинов Н.Н., Фахруллин Р.Ф., Бойчук С.В., Фатхутдинова Л.М.http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/72105

Aim. Comparative assessment of the effect of fibrous materials on cell cultures RAW264.7 and BEAS-2B.

Methods. The effects of various fibrous materials — single-walled carbon nanotubes of two types (SWCNT-1 and SWCNT-2), differing in morphological characteristics, and chrysotile asbestos as a positive control — was assessed on two cell lines macrophages RAW 264.7 and human bronchial epithelium BEAS-2B cells. The studied materials’ concentration range for experiments on cells was selected taking into account the SWCNT content in the air of the working area and the subsequent modeling of SWCNT deposition in the human respiratory tract. Suspensions of the studied materials were prepared based on cell culture media by ultrasonication. Cytotoxicity assessment after 48 hours of incubation was performed by using the MTS colorimetric assay. The expression level of apoptosis mar¬kers was assessed by immunoblotting using the corresponding monoclonal antibodies. Visualization of SWCNT-1, SWCNT-2 and chrysotile asbestos in BEAS-2B cell cultures was carried out by improved dark-field microscopy.

Results. According to dark-field microscopy, all the studied fibrous materials were found on the surface or cytoplasm of the cells. SWCNT and chrysotile asbestos did not have a direct cytotoxic effect in the MTS assay and did not induce apoptosis according to the results of Western blotting in cell cultures of RAW264.7 macrophages and BEAS-2B bronchial epithelium. In the cells of the bronchial epithelium (BEAS-2B) that showed greater sensitivity, a slight increase in the expression of pro-apoptotic protein PARP, which was more pronounced for shorter SWCNT-2, was revealed.

Conclusion. Both types of SWCNTs, despite the differences in morphological characteristics, demonstrated similar effects in in vitro experiments; this result, with its further verification, can have an important practical application in justifying approaches to determining the safety criteria for single-walled carbon nanotubes as a class of nanomaterials of the same type.

Цель. Сравнительная оценка воздействия волокнистых материалов на клеточных культурах RAW264.7 и BEAS-2B.

Методы. На двух клеточных линиях — макрофагах RAW 264.7 и клетках человеческого бронхиального эпителия BEAS-2В — оценивали воздействие различных волокнистых материалов: неочищенных одностенных углеродных нанотрубок двух типов (ОУНТ-1 и ОУНТ-2), различавшихся длиной и другими морфологическими характеристиками, и хризотил-асбеста в качестве положительного контроля. Диапазон концентраций исследуемых веществ для внесения в клетки был выбран с учётом содержания ОУНТ в воздухе рабочей зоны и последующего моделирования депонирования ОУНТ в дыхательных путях человека. Суспензии исследуемых материалов были подготовлены на основе клеточных культуральных сред методом ультразвуковой соникации. Оценку цитотоксичности после 48-часового культивирования клеток проводили с помощью колометрического MTS-теста. Методом иммуноблоттинга оценивали уровень экспрессии белков-маркёров апоптоза с использованием соответствующих моноклональных антител. Визуализация ОУНТ-1, ОУНТ-2 и хризотил-асбеста в культурах клеток BEAS-2B проведена методом улучшенной темнопольной микроскопии.

Результаты. По данным темнопольной микроскопии все изученные волокнистые материалы обнаружены на поверхности или в цитоплазме клеток. ОУНТ и хризотил-асбест не оказывали прямого цитотоксического действия в МТS-тесте и не вызывали апоптоз по результатам вестерн-блота в клеточных культурах макрофагов RAW264.7 и бронхиального эпителия BEAS-2B. В проявивших большую чувствительность клетках бронхиального эпителия (BEAS-2B) выявлено небольшое повышение экспрессии сигнального апоптического белка ПАРП [поли-(АДФ-рибозил)-полимераза], более выраженное для более коротких ОУНТ-2.

Вывод. Оба типа одностенных углеродных нанотрубок, несмотря на различия в морфологических характеристиках, демонстрировали схожие эффекты в экспериментах in vitro; этот результат при его дальнейшей верификации может иметь важное практическое применение при обосновании подходов к определению критериев безопасности одностенных углеродных нанотрубок как однотипного класса наноматериалов.

single-walled carbon nanotubesRAW264.7 macrophagesbronchial epithelial BEAS-2B cellsdark-field microscopyодностенные углеродные нанотрубкимакрофаги RAW264.7клетки бронхиального эпителия BEAS-2Bтемнопольная микроскопияИсследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №19-315-90046. Разработка методов визуализации материалов в клетках (Фахруллин Р.Ф.) выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации для молодых учёных (№МД-2153.2020.3).Carbon nanotubes. https://www.transparency market research.com/pressrelease/carbon-nano-tubes-market.htm (дата обращения: 12.06.2021).Liu Z., Tabakman S., Welsher K., Dai H. Carbon nanotubes in biology and medicine: In vitro and in vivo detection, imaging and drug delivery. Nano Res. 2009; 2: 85–120. DOI: 10.1007/s12274-009-9009-8.Bianco A., Kostarelos K., Prato M. Applications of carbon nanotubes in drug delivery. Curr. Opin. Chem. Biol. 2005; (6): 674–679. DOI: 10.1016/j.cbpa.2005.10.005.Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 1990; (22): 6531–6535. DOI: 10.1093/nar/18.22.6531.Kisin E.R., Murray A.R., Keane M.J., Shi X.C., Schwegler-Berry D., Gorelik O., Arepalli S., Castranova V., Wallace W.E., Kagan V.E., Shvedova A.A. Single-walled carbon nanotubes: geno- and cytotoxic effects in lung fibroblast V79 cells. J. Toxicol. Environ Health A. 2007; (24): 2071–2079. DOI: 10.1080/15287390701601251.Magdolenova Z., Collins A., Kumar A., Dhawan A., Stone V., Dusinska M. Mechanisms of genotoxi­city. A review of in vitro and in vivo studies with engineered nanoparticles. Nanotoxicology. 2014; 8 (3): 233–278. DOI: 10.3109/17435390.2013.773464.Li Y., Doak S.H., Yan J., Chen D.H., Zhou M., Mittelstaedt R.A., Chen Y., Li C., Chen T. Factors affecting the in ­vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials. Mutagenesis. 2017; 32 (1): 151–159. DOI: 10.1093/mutage/gew040.Herzog E., Casey A., Lyng F.M., Chambers G., ­Byrne H.J., Davoren M. A new approach to the toxicity tes­ting of carbon-based nanomaterials — the clonoge­nic assay. Toxicol. Letters. 2007; 174 (1–3): 49–60. DOI: 10.1016/j.toxlet.2007.08.009.Park E.J., Zahari N.E., Lee E.W., Song J., Lee J.H., Cho M.H., Kim J.H. SWCNTs induced autophagic cell death in human bronchial epithelial cells. Toxicol. in vitro. 2014; 28 (3): 442–450. DOI: 10.1016/j.tiv.2013.12.012.Khaliullin T.O., Kisin E.R., Murray R.A., Zalyalov R.R., Shvedova A.A., Fatkhutdinova L.M. Toxic effects of carbon nanotubes in macrophage and bronchial epithelium cell cultures. Tomsk State University journal of biology. 2014; (1): 199–210. (In Russ.)Халиуллин Т.О., Кисин Е.Р., Мюррэй Р.Э., Залялов Р.Р., Шведова А.А., Фатхутдинова Л.М. Токсические эффекты углеродных нанотрубок в культурах клеток макрофагов и бронхиального эпителия. Вестн. Томского гос. ун-та. Биология. 2014; (1): 199–210.Davoren M., Herzog E., Casey A., Cottineau B., Chambers G., Byrne H.J., Lyng F.M. In vitro toxicity eva­luation of single walled carbon nanotubes on human A549 lung cells. Toxicol. in vitro. 2007; 21 (3): 438–448. DOI: 10.1016/j.tiv.2006.10.007.Pulskamp K., Diabaté S., Krug H.F. Carbon nanotubes show no sign of acute toxicity but induce intracellular reactive oxygen species in dependence on contaminants. Toxicol. Letters. 2007; 168 (1): 58–74. DOI: 10.1016/j.toxlet.2006.11.001.Wörle-Knirsch J.M., Pulskamp K., Krug H.F. Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays. Nano Letters. 2006; 6 (6): 1261–1268. DOI: 10.1021/nl060177c.Fujita K., Fukuda M., Endoh S., Kato H., Maru J., Nakamura A., Uchino K., Shinohara N., Obara S., Nagano R., Horie M., Kinugasa S., Hashimoto H., Kishimoto A. Physical properties of single — wall carbon nanotubes in cell culture and their dispersal due to alveolar epithelial cell response. Toxicol. Mechanisms аnd Methods. 2013; 23 (8): 598–609. DOI: 10.3109/15376516.2013.811568.Clift M.J., Endes C., Vanhecke D., Wick P., Gehr P., Schins R.P., Petri-Fink A., Rothen-Rutishauser B. A comparative study of different in vitro lung cell culture systems to assess the most beneficial tool for screening the potential adverse effects of carbon nanotubes. Toxicol. Sci. 2014; 137 (1): 55–64. DOI: 10.1093/toxsci/kft216.Witasp E., Shvedova A.A., Kagan V.E., Fadeel B. Single-walled carbon nanotubes impair human macrophage engulfment of apoptotic cell ­corpses. Inhalation Toxicol. 2009; 21 (Suppl. 1): 131–136. DOI: 10.1080/08958370902942574.Khaliullin T.O., Kisin E.R., Murray A.R., Yanamala N., Shurin M.R., Gutkin D.W., Fatkhutdinova L.M., Kagan V.E., Shvedova A.A. Mediation of the single-walled carbon nanotubes induced pulmonary fibrogenic response by osteopontin and TGF-β1. Experim. Lung Res. 2017; 43 (8): 311–326. DOI: 10.1080/01902148.2017.1377783.Murr L.E., Garza K.M., Soto K.F., Carrasco A., Powell T.G., Ramirez D.A., Guerrero P.A., Lopez D.A., Venzor J.3rd. Cytotoxicity assessment of some carbon nanotubes and related carbon nanoparticle aggregates and the implications for anthropogenic carbon nanotube aggregates in the environment. Intern. J. Envir. Res. Public Health. 2005; 2 (1): 31–42. DOI: 10.3390/ijerph2005010031.Migliore L., Saracino D., Bonelli A., Colognato R., R.D’Errico M., Magrini A., Bergamaschi A., Bergamaschi E. Carbon nanotubes induce oxidative DNA da­mage in RAW264.7 cells. Envir. Mol. Mutagen. 2010; 51: 294–303. DOI: 10.1002/em.20545.Dong P.X., Wan B., Guo L.H. In vitro toxicity of acid-functionalized single-walled carbon nanotubes: effects on murine macrophages and gene expression profiling. Nanotoxicology. 2012; 6 (3): 288–303. DOI: 10.3109/17435390.2011.573101.Donaldson K., Aitken R., Tran L., Stone V., Duffin R., Forrest G., Alexander A. Carbon nanotubes: a review of their properties in relation to pulmonary toxi-­cology and workplace safety. Toxicol. Sci. 2006; 92 (1): 5–22. DOI: 10.1093/toxsci/kfj130.National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH). https://www.cdc.gov/niosh/index.htm (access date: 12.06.2021).Multiple-Path Particle Dosimetry Model (MPPD v 3.04). https://www.ara.com/products/multiple-path-particle-dosimetry-model-mppd-v-304 (access date: 14.06.2021).Li Y., Boraschi D. Endotoxin contamination: a key ­element in the interpretation of nanosafety ­studies. Nanome­dicine (Lond.). 2016; 11 (3): 269. DOI: 10.221/nnm.15.19619.State Pharmacopoeia of the Russian Federation XIV edition (approved by order of the Ministry of Health of the Russian Federation on October 31, 2018). https://minzdrav.gov.ru/ministry/61/11/gosudarstvennaya-farmakopeya-rossiyskoy-federatsii-xiv-izdaniya (access date: 14.06.2021)Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания (ГФ РФ XIV) (утв. приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации 31 октября 2018 г.). https://minzdrav.gov.ru/ministry/61/11/gosudarstvennaya-farmakopeya-rossiyskoy-federatsii-xiv-izdaniya (дата обращения: 14.06.2021).Timerbulatova G., Dimiev A.M., Khamidullin T., Boichuk S.V., Dunaev P., Fakhrullin R., Khaertdinov N.N., Porfiryeva N.N., Khaliullin T., Fatkhutdinova L. Dispersion of single-walled carbon nanotubes in biocompatible environments. Nanotechnologies in Russia. 2020; 15: 437–444. DOI: 10.1134/S1995078020040163.Methodical instructions MU 1.2.2635-10 “Medical and biological assessment of the safety of nanomaterials” (approved by the Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation G.G. Onishchenko on May 24, 2010). https://docs.cntd.ru/document/1200083582 (access date: 14.06.2021)Методические указания МУ 1.2.2635-10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов» (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 мая 2010 г.) https://docs.cntd.ru/document/1200083582 (дата обращения: 14.06.2021).Cherednichenko Y.V., Nigamatzyanova L.R., Akhatova F.S., Rozhina E.V., Fakhrullin R.F., Evtugyn V.G. Silver nanoparticle synthesis using ultrasound and halloysite to create a nanocomposite with antibacterial pro­perties. Nanotechnologies in Russia. 2019; 14 (9–10): 456–461. DOI: 10.1134/S1995078019050021.Чередниченко Ю.В., Евтюгин В.Г., Нигаматзянова Л.Р., Ахатова Ф.С., Рожина Э.В., Фахруллин Р.Ф. Синтез наночастиц серебра при помощи ультразвука и галлуазита для создания нанокомпозита с антибактериальными свойствами. Рос. нанотехнол. 2019; 14 (9–10): 64–70. DOI: 10.1134/S1995078019050021.Fakhrullin R., Nigamatzyanova L., Fakhrullina G. Dark-field/hyperspectral microscopy for detecting nanoscale particles in environmental nanotoxicology research. Sci. Total Environment. 2021; 772: 145 478. DOI: 10.1016/j.scitotenv.2021.145478.Park E.J., Zahari N.E., Kang M.S., Lee S.J., Lee K., Lee B.S., Yoon C., Cho M.H., Kim Y., Kim J.H. Toxic response of HIPCO single-walled carbon nanotubes in mice and RAW264.7 macrophage cells. Toxicol. Lett. 2014; 229 (1): 167–177. DOI: 10.1016/j.toxlet.2014.06.015.Kharissova O.V., Kharisov B.I., de Casas Ortiz E.G. Dispersion of carbon nanotubes in water and non-aqueous solvents. RSC Adv. 2013; 3: 24 812–24 852. DOI: 10.1039/c3ra43852.Ghosh M., Murugadoss S., Janssen L., Cokic S., Mathyssen C., Van Landuyt K., Janssens W., Carpentier S., Godderis L., Hoet P. Distinct autophagy-apoptosis rela­ted pathways activated by Multi-walled (NM 400) and ­Single-walled carbon nanotubes (NIST-SRM2483) in human bronchial epithelial (16HBE14o-) cells. J. Hazard Mater. 2020; 387: 121691. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2019.121691.Shvedova A.A., Yanamala N., Kisin E.R., Tkach A.V., Murray A.R., Hubbs A., Chirila M.M., Keohavong P., Sycheva L.P., Kagan V.E., Castranova V. Long-term effects of carbon containing engineered nanomaterials and asbestos in the lung: one year postexposure comparisons. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2014; 306 (2): 170–182. DOI: 10.1152/ajplung.00167.2013.