BACKGROUND: Immunothrombosis, or inflammatory thrombosis, largely determines the course and outcomes of severe infectious and autoimmune diseases. Inflammatory thrombi are rich in neutrophils; however, how inflammatory cells affect the contraction (retraction) of a blood clot, an important process that influences the course and outcomes of hemostatic disorders, remains unknown.
AIM: This study aimed to assess the effect of activated neutrophils and neutrophil extracellular traps on the rate and degree of blood clot retraction mediated by activated platelet contraction.
METHODS: Isolated human neutrophils were activated with phorbol 12-myristate 13-acetate to induce the formation of neutrophil extracellular traps, which were visualized using immunofluorescence (citrullinated histone H3 and DNA) and scanning electron microscopy. Thrombin-induced clots were formed for three sample groups from whole blood (n = 5 for each group) or platelet-rich plasma (n = 4 or n = 5 for each group): (1) without added neutrophils (control), (2) with nonactivated neutrophils, and (3) with activated neutrophils. Clot-retraction kinetics were recorded optically. The final degree of retraction was the difference between the initial and final clot size, expressed as a percentage of the initial value. Statistical analysis was performed using the Student’s t-test, one-way analysis of variance with a Sidak post hoc test, and the Friedman test. The significance level was set at 95%.
RESULTS: Phorbol 12-myristate 13-acetate induced the activation of neutrophils and formation of neutrophil extracellular traps, which merged into the fibrin structure. When added to whole blood or platelet-rich plasma, activated neutrophils significantly (p < 0.05) increased the final degree of clot retraction (50% ± 5% in blood and 86% ± 3% in platelet-rich plasma) compared with nonactivated neutrophils (45% ± 3% and 80% ± 1%, respectively). The kinetic parameters of retraction demonstrated accelerated contraction in the presence of activated neutrophils (greater mean velocity in platelet-rich plasma: 0.070%/s ± 0.003%/s vs. 0.065%/s ± 0.001%/s; p = 0.03). The stimulatory effect of activated neutrophils on clot retraction disappeared following neutrophil extracellular trap degradation with deoxyribonuclease I, in whole blood (degree of retraction 44% ± 5% vs. 54% ± 2%; p = 0.02) and platelet-rich plasma (82% ± 3% vs. 87% ± 2%; p = 0.03), indicating a key role of neutrophil extracellular traps within clots.
CONCLUSION: Activated neutrophils accelerate and enhance blood clot retraction. This effect is mediated by the formation of neutrophil extracellular traps that merge into the fibrin network.
Обоснование. Иммунотромбоз, или воспалительный тромбоз, во многом определяет течение и исходы тяжёлых форм инфекционных и аутоиммунных заболеваний. Воспалительные тромбы богаты нейтрофилами, однако остаётся неизвестным, как воспалительные клетки влияют на сжатие (ретракцию) сгустка крови — важный процесс, определяющий течение и исходы гемостатических расстройств.
Цель исследования. Оценить влияние активированных нейтрофилов и нейтрофильных внеклеточных ловушек на скорость и степень ретракции сгустков крови, опосредованной сокращением активированных тромбоцитов.
Методы. Изолированные человеческие нейтрофилы активировали форбол-12-миристат-13-ацетатом для индукции образования нейтрофильных внеклеточных ловушек, которые визуализировали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания цитруллинированных H3-гистонов и флуоресцентного окрашивания ДНК, а также с помощью сканирующей электронной микроскопии. Сгустки, индуцированные тромбином, формировали для трёх групп образцов из цельной крови (n = 5 для каждой группы) или богатой тромбоцитами плазмы (n = 4 или n = 5 для каждой группы), а именно: (1) без добавления нейтрофилов (контроль); в присутствии (2) неактивированных или (3) активированных нейтрофилов. Кинетику ретракции сгустка регистрировали оптически. Конечную степень ретракции определяли как разницу между исходным и конечным размерами сгустка, выраженную в процентах от исходного значения. Для статистической обработки применяли t-критерий Стьюдента, однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным тестом Сидака и критерий Фридмана; уровень значимости составлял 95%.
Результаты. Форбол-12-миристат-13-ацетат вызывал активацию нейтрофилов и инициировал образование нейтрофильных внеклеточных ловушек, которые встраивались в структуру фибрина. При добавлении в кровь или богатую тромбоцитами плазму активированные нейтрофилы значимо (p < 0,05) увеличивали конечную степень ретракции сгустка (50 ± 5% в крови, 86 ± 3% в богатой тромбоцитами плазме) по сравнению с контрольными неактивированными нейтрофилами (45 ± 3% и 80 ± 1% соответственно). Кинетические параметры ретракции указывали на ускоренное сжатие в присутствии активированных нейтрофилов (увеличение средней скорости в богатой тромбоцитами плазме: 0,070 ± 0,003%/с против 0,065 ± 0,001%/с; p = 0,03). Стимулирующий эффект активированных нейтрофилов на ретракцию сгустков исчезал после расщепления нейтрофильных внеклеточных ловушек дезоксирибонуклеазой I как в цельной крови (степень ретракции 44 ± 5% против 54 ± 2%; p = 0,02), так и в богатой тромбоцитами плазме (82 ± 3% против 87 ± 2%, p = 0,03), что указывает на ключевую роль нейтрофильных внеклеточных ловушек в составе сгустков.
Заключение. Активированные нейтрофилы ускоряют и усиливают ретракцию сгустков крови, и этот эффект обусловлен образованием нейтрофильных внеклеточных ловушек, встроенных в фибриновую сеть.