Aim. To conduct a comparative analysis of the microbiome of biopsies of a tumor and normal intestinal epithelium of patients diagnosed with colorectal cancer and to identify of functional activities of the obtained bacterial isolates that affect the development of the tumor.
Methods. The study included 50 patients with malignant neoplasms of the colon: 36 men and 24 women. The mean age of the patients was 64.1±10.2 years. To analyze the microbiota of the biopsies, DNA samples were obtained from the tissue of the unaffected colon mucosa and tumor of the patients. Bacterial 16S rRNA genes fragments were amplified using bar-coded primer bakt_341f. Metagenomic next-generation sequencing was performed using the MiSeq platform (Illumina, USA). The obtained data were processed by bioinformatic methods using the QIIME package. Recognition of microorganisms depending on the morphotype and gram staining of the microflora was carried out using combination differential media and biochemical tests. Statistical analysis was carried out using Microsoft Excel, Service Pack 2 for Office XP, Statistica 6.0 (StatSoft). A comparative analysis was performed with the Student's t-test and the Mann–Whitney test in case of unmet conditions of validity. Alpha diversity of bacterial communities was quantified by the Shannon diversity index and the UniFrac distance for beta diversity analysis.
Results. In patients with colorectal cancer, 5 bacterial phyla were isolated, the predominant of which were Firmicutes and Bacteroidetes, while the content of Actinobacteria was low. In addition, a higher number of representatives of Fusobacteria was observed in the tumor tissue compared to the tissue of a healthy mucosa, at a distance of 5 centimeters proximal to the tumor. The results of this study indicate that the microbiome of a tumor and a healthy mucosa fundamentally differ from each other not only in morphotype and gram staining but also in antagonistic, hemolytic and ribonucleolytic activities.
Conclusion. Colonization of the tumor by dominant aggressive Gram-negative bacteria leads to significant changes in the tumor microbiome composition compared with normal mucosa, whose representatives are displaced from the damaged epithelium by more aggressive strains.
Цель. Сравнительный анализ микробиома биоптатов опухолевого и нормального кишечного эпителия пациентов с диагностированным колоректальным раком и выявление функциональных активностей выделенных изолятов бактерий, влияющих на развитие опухоли.
Методы. В исследование включены 50 больных злокачественными новообразованиями толстой кишки: 36 мужчин и 24 женщины. Средний возраст пациентов составил 64,1±10,2 года. Для анализа микробиоты биоптатов образцы ДНК получали из ткани непоражённой слизистой оболочки толстой кишки и опухоли. Фрагменты генов бактериальной 16S рРНК амплифицировали с помощью штрих-кодированных праймеров Bakt_341F. Метагеномное секвенирование нового поколения было выполнено на платформе MiSeq. Полученные данные обрабатывали биоинформационными методами с использованием пакета QIIME. Распознавание микроорганизмов в зависимости от морфотипа и грам-принадлежности микрофлоры проводили с использованием дифференциальных комбинированных сред и биохимических тестов. Статистическую обработку данных проводили с использованием приложений Microsoft Excel, пакета обновления 2 для Office XP, Statistica (StatSoft) версии 6.0. Для проведения сравнительного анализа полученных данных применяли t-критерий Стьюдента, а в случае несоответствия его условиям — критерий Манна–Уитни. Для оценки α-разнообразия бактериальных сообществ использовали индекс Шеннона, β-разнообразие сообществ оценивали по методу UniFrac.
Результаты. У больных колоректальным раком выделено 5 бактериальных фил, преобладающими из которых были Firmicutes и Bacteroidetes, в то время как содержание Actinobacteria было низким. Кроме того, в опухолевой ткани отмечено более высокое количество представителей Fusobacteria по сравнению с тканью здоровой слизистой оболочки, на расстоянии 5 см проксимальнее опухоли. Полученные результаты свидетельствуют о том, что микробиом опухоли и здоровой слизистой оболочки принципиально различается не только по морфотипу и грам-принадлежности, но и по антагонистической, гемолитической и рибонуклеотической активности.
Вывод. Колонизация опухоли доминирующими грамотрицательными бактериями с выраженными агрессивными свойствами приводит к значительным изменениям состава опухолевого микробиома по сравнению со здоровой слизистой оболочкой, представители которой вытесняются с повреждённого эпителия более агрессивными штаммами.