Kazan medical journalKazan medical journalКазанский медицинский журнал0368-48142587-9359Eco-Vector1101810.17816/KMJ2019-153Experimental medicineЭкспериментальная медицинаResearch ArticleCytoprotective effect of non-opioid leu-enkephalin analogue in primary culture of pulmonary fibroblasts in oxidative stressЦитопротективный эффект неопиатного аналога лей-энкефалина в первичной культуре пульмональных фибробластов в условиях окислительного стрессаSazonovaE NСазоноваЕлена Николаевнаsazen@mail.ruLebed’koO AЛебедькоОльга Антоновнаsazen@mail.ruDenisyukG AДенисюкГалина Александровнаsazen@mail.ruZhmerenetskiyK VЖмеренецкийКонстантин Вячеславовичsazen@mail.ruDobrykhV AДобрыхВячеслав Анатольевичsazen@mail.ruThe Far-Eastern State Medical UniversityДальневосточный государственный медицинский университетKhabarovsk Branch of Far-Eastern Research Center of Physiology and Pathology of Respiration, Scientific Research Institute of Maternity and Childhood ProtectionХабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания - Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства080220191001VOL 100, NO1 (2019)ТОМ 100, №1 (2019)15315708022019Copyright ©; 2019, Sazonova E.N., Lebed’ko O.A., Denisyuk G.A., Zhmerenetskiy K.V., Dobrykh V.A.Copyright ©; 2019, Сазонова Е.Н., Лебедько О.А., Денисюк Г.А., Жмеренецкий К.В., Добрых В.А.2019Sazonova E.N., Lebed’ko O.A., Denisyuk G.A., Zhmerenetskiy K.V., Dobrykh V.A.Сазонова Е.Н., Лебедько О.А., Денисюк Г.А., Жмеренецкий К.В., Добрых В.А.http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/11018

Aim. Analysis of the cytoprotective effect of non-opioid leu-enkephalin analogue (Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) in the primary culture of pulmonary fibroblasts in conditions of oxidative stress.

Methods. Pulmonary fibroblasts were incubated with the peptide of non-opioid leu-enkephalin analogue (Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) in the concentration 0.1 μM for 6 hours. To simulate oxidative stress, 60 μM H2O2 was added to the culture medium for 2 hours. Experimental series included (1) «control»; (2) «non-opiate leu-enkephalin analogue» (the peptide was added to the culture medium 44 hours after the final passage); (3) «oxidative stress» (H2O2 was added to the culture medium 48 hours after the final passage); (4) «non-opiate leu-enkephalin analogue + oxidative stress» (the peptide and H2O2 were added to the culture medium 44 and 48 hours respectively after the final passage). In order to evaluate the generation of superoxide anion by pulmonary fibroblasts, the method of lucigenin-dependent chemiluminescence was used. Computer morphometry of the nucleo-nucleolar apparatus of fibroblasts stained with silver nitrate by the AgNOR method was used to assess the cell state: the area of fibroblast nuclei, the total nucleoli area in the nucleus, and the number of nucleoli in the nucleus were measured. These parameters correlate with the activity of anabolic processes in the cells.

Results. The effect of H2O2 on the primary culture of pulmonary fibroblasts caused an increase of superoxide anion generation by the fibroblasts, reduction of fibroblast nuclei size, decrease of nucleoli amount and size. Pre-incubation of pulmonary fibroblasts with a non-opioid leu-enkephalin analogue reduced the H2O2-induced generation of superoxide anion, corrected changes in the nucleo-nucleolar apparatus of fibroblasts caused by oxidative stress. In our previous studies, similar effect in the same model was shown for non-selective μ/δ-opioid receptor agonist peptide sedatin (dermorphin analogue). The mechanism of cytoprotective effect of non-opioid leu-enkephalin analogue may include the affinity of this peptide to nociceptin receptors (NOR receptors) that requires further studies.

Conclusion. The results of the study indicate a direct cytoprotective effect of the peptide Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg (non-opioid leu-enkephalin analogue) in oxidative stress.

Цель. Анализ цитопротективного влияния неопиатного аналога лей-энкефалина (Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) в первичной культуре пульмональных фибробластов в условиях окислительного стресса.

Методы. Инкубацию пульмональных фибробластов с неопиатным аналогом лей-энкефалина (Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) проводили в течение 6 ч при концентрации пептида в культуральной среде 0,1 мкМ. Для моделирования окислительного стресса в культуральную среду на 2 ч добавляли 60 мкМ Н2О2. Экспериментальные серии включали: (1) «контроль»; (2) «неопиатный аналог лей-энкефалина» (пептид добавляли в культуральную среду через 44 ч после заключительного пересева); (3) «окислительный стресс» (Н2О2 добавляли в культуральную среду через 48 ч после заключительного пересева); (4) «неопиатный аналог лей-энкефалина + окислительный стресс» (пептид добавляли в культуральную среду через 44 ч, Н2О2 - через 48 ч после заключительного пересева). Для оценки процессов образования пульмональными фибробластами радикалов супероксид-аниона использовали метод люцигенин-зависимой хемилюминесценции. Состояние клеток оценивали с помощью компьютерной морфометрии нуклео-нуклеолярного аппарата фибробластов, окрашенных азотнокислым серебром по методу AgNOR: измеряли площадь ядер фибробластов и суммарную площадь ядрышек в ядре, определяли количество ядрышек в ядре. Указанные параметры коррелируют с активностью анаболических процессов в клетке.

Результаты. Воздействие Н2О2 на первичную культуру пульмональных фибробластов вызывало повышение генерации фибробластами радикалов супероксид-аниона, уменьшение размеров ядер фибробластов, снижение количества и размеров ядрышек. Предварительная инкубация пульмональных фибробластов с неопиатным аналогом лей-энкефалина уменьшала индуцированное Н2О2 образование радикалов супероксид-аниона, корректировала вызванные окислительным стрессом изменения нуклео-нуклеолярного аппарата фибробластов. В проведённых ранее исследованиях аналогичный эффект на сходной модели демонстрировал неселективный агонист µ/δ-опиатных рецепторов аналог дерморфина пептид седатин. В качестве механизмов реализации цитопротективного эффекта неопиатного аналога лей-энкефалина предполагается его взаимодействие с рецепторами ноцицептина (NOR-рецепторами), что требует дальнейшего исследования.

Вывод. Результаты проведённого исследования указывают на наличие у пептида Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg (неопиатного аналога лей-энкефалина) прямого цитопротективного эффекта в условиях окислительного стресса.

biologically active peptideoxidative stressnucleolicytoprotective effectбиологически активные пептидыокислительный стрессядрышкицитопротективный эффектLishmanov Yu.B., Maslov L.N., Naryzhnaya N.V. et al. Endogenous opioid system as part of the urgent and long-term adaptation of the organism to extreme effects. Perspectives of clinical use of opioid peptides. Vestnik RAMN. 2012; (6): 73–82. (In Russ.)Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., Нарыжная Н.В. и др. Эндогенная опиоидная система как звено срочной и долговременной адаптации организма к экстремальным воздействиям. Перспективы клинического применения опиоидных пептидов. Вестн. РАМН. 2012; (6): 73-82. DOI: 10.15690/vramn.v67i6.287.Staples M., Acosta S., Tajiri N. et al. Delta opioid receptor and its peptide: a receptor-ligand neuroprotection. Int. J. Mol. Sci. 2013; 14 (9): 17 410–17 419. DOI: 10.3390/ijms140917410.Staples M., Acosta S., Tajiri N. et al. Delta opioid receptor and its peptide: a receptor-ligand neuroprotection. Int. J. Mol. Sci. 2013; 14 (9): 17 410-17 419. DOI: 10.3390/ijms140917410.He H., Huh J., Wang H. et al. Mitochondrial events responsible for morphine's cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2016; 290: 66–73. DOI: 10.1016/j.taap.2015.11.019.He H., Huh J., Wang H. et al. Mitochondrial events responsible for morphine's cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2016; 290: 66-73. DOI: 10.1016/j.taap.2015.11.019.Zhivotova E.Yu., Lebed'ko O.A., Timoshin S.S. The effect of structural analogues of leu-enkephalin on the DNA synthesis and free radical oxidation in the stomach mucosa of albino rats. Dal'nevostochnyy meditsinskiy zhurnal. 2012; (1): 109–112. (In Russ.)Животова Е.Ю., Лебедько О.А., Тимошин С.С. Влияние структурных аналогов лей-энкефалина на процессы синтеза ДНК и свободнорадикальное окисление в слизистой оболочке желудка белых крыс. Дальневосточный мед. ж. 2012; (1): 109-112.Metzger T.G., Ferguson D.M. On the role of extracellular loops of opioid receptors in conferring ligand selectivity. FEBS Lett. 1995; 375 (1–2): 1–4. DOI: 10.1016/0014-5793(95)01185-H.Metzger T.G., Ferguson D.M. On the role of extracellular loops of opioid receptors in conferring ligand selectivity. FEBS Lett. 1995; 375 (1-2): 1-4. DOI: 10.1016/0014-5793(95)01185-H.Simankova A.A., Lebed'ko O.A., Sazonova E.N. Effect of regulatory opioid peptides on early postnatal cerebral consequences of antenatal hypoxia. Dal'nevostochnyy meditsinskiy zhurnal. 2015; (4): 76–80. (In Russ.)Симанкова А.А., Лебедько О.А., Сазонова Е.Н. Влияние регуляторных пептидов семейства опиоидов на ранние постнатальные церебральные последствия антенатальной гипоксии. Дальневосточный мед. ж. 2015; (4): 76-80.Samokhvalov V.A., Smetanina M.D., Museykina N.Yu. et al. The influence of low concentration of hydrogen peroxide on blood cell metabolism. Biomeditsinskaya khimiya. 2003; (2): 122–127. (In Russ.)Самохвалов В.А., Сметанина М.Д., Мусейкина Н.Ю. и др. Влияние низкой концентрации перекиси водорода на метаболизм клеток крови. Биомед. хим. 2003; (2): 122-127.Vladimirov Yu.A., Proskurnina E.V. Free radicals and cell chemilumine­scence. Uspekhi biologicheskoj himii. 2009; 49: 341–388. (In Russ.)Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция. Успехи биол. хим. 2009; 49: 341-388.O’Donnell V.B., Azzi A. High rates of extracellular superoxide generation by cultured human fibroblasts: involvement of a lipid-metabolizing enzyme. Biochem. J. 1996; 318 (Pt. 3): 805–812. DOI: 10.1042/bj3180805.O’Donnell V.B., Azzi A. High rates of extracellular superoxide generation by cultured human fibroblasts: involvement of a lipid-metabolizing enzyme. Biochem. J. 1996; 318 (Pt. 3): 805-812. DOI: 10.1042/bj3180805.Korzhevskiy D.E. Impregnation with silver nitrate of intranuclear structures of nerve cells after fixation in Carnoy fluid. Morfologiya. 2001; (2): 67–69. (In Russ.)Коржевский Д.Э. Импрегнация нитратом серебра внутриядерных структур нервных клеток после фиксации в жидкости Карнуа. Морфология. 2001; (2): 67-69.Frolova O.E. Morphofunctional characteristics of monocytes. The significance of the research of the nucleolar apparatus. Kliniko-laboratornaya diagnostika. 1998; (10): 3–8. (In Russ.)Фролова О.Е. Морфофункциональная характеристика моноцитов. Значение исследования нуклеолярного аппарата. Клин.-лаб. диагностика. 1998; (10): 3-8.Mamaev N.N., Mamaeva S.E. Structure and function of nucleolus organizing regions of chromosomes: molecular, cytological and clinical aspects. Citologiya. 1992; 34 (10): 3–15. (In Russ.)Мамаев Н.Н., Мамаева С.Е. Структура и функция ядрышкообразующих районов хромосом: молекулярные, цитологические и клинические аспекты. Цитология. 1992; 34 (10): 3-15.Wnuk M., Lewinska A., Bugno M. et al. Oxidant-induced decrease of the expression of nucleolar organizer regions in pig lymphocytes can be useful for monitoring the cellular effects of oxidative stress. Mutat. Res. 2008; 653 (1–2): 124–129. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2008.04.006.Wnuk M., Lewinska A., Bugno M. et al. Oxidant-induced decrease of the expression of nucleolar organizer regions in pig lymphocytes can be useful for monitoring the cellular effects of oxidative stress. Mutat. Res. 2008; 653 (1-2): 124-129. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2008.04.006.Sazonova E.N., Samarina E.Y., Lebed'ko O.A. et al. Cytoprotective effect of peptide sedatin, an agonist of μ/δ-opioid receptors, on primary culture of pulmonary fibroblasts of albino rats under conditions of oxidative stress. Bulleten' Experimental'noy Biologii i Meditsiny. 2016; 161 (1): 51–54. (In Russ.)Сазонова Е.Н., Самарина Е.Ю., Лебедько О.А. и др. Цитопротективное влияние агониста μ/δ-опиоидных рецепторов пептида седатин на первичную культуру пульмональных фибробластов белых крыс в условиях оксидативного стресса. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2016; 161 (1): 51-54. DOI: 10.1007/s10517-016-3340-3.Toll L., Bruchas M.R., Calo G. et al. Nociceptin/Orphanin FQ receptor structure, signaling, functions and interactions with opioid systems. Pharmacol. Rev. 2016; 68: 419–457. DOI: 10.1124/pr.114.009209.Toll L., Bruchas M.R., Calo G. et al. Nociceptin/Orphanin FQ receptor structure, signaling, functions and interactions with opioid systems. Pharmacol. Rev. 2016; 68: 419-457. DOI: 10.1124/pr.114.009209.