Liquid biopsy of plasma and cerebrospinal fluid for the detection of extracellular tumor DNA as a tool for glioma diagnosis and genotyping: a cross-sectional observational pilot study

Full Text

Обоснование

Глиомы составляют около 80% всех злокачественных опухолей центральной нервной системы [1]. Более 60% из них представляют собой глиобластомы, характеризующиеся пятилетней относительной выживаемостью менее 7%. Остальные глиомы высокой степени злокачественности имеют пятилетнюю относительную выживаемость около 30–40% [1, 2]. Из-за значительного морфологического сходства глиом их визуальная оценка с помощью только гистопатологического исследования не даёт полной информации о степени злокачественности опухоли [1, 3–5]. В связи с этим для верификации диагноза, оценки прогноза и выбора тактики лечения с 2016 года рекомендуется проведение генетического типирования опухоли [1, 3–5]. Большинство глиом степени 4 по Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) имеют мутации промотера TERT (pTERT), тогда как мутации IDH1 встречаются лишь в 5–10% случаев. Напротив, глиомы степени 1–3 чаще содержат мутации IDH1. Опухоли с IDH дикого типа, как правило, требуют более агрессивной терапии [1, 3–5]. Выявление аберраций в гене BRAF также служит предпосылкой к назначению ингибиторов продуктов экспрессии BRAF (дабрафениб) и MEK (траметиниб) [6]. В то же время отсутствие метилирования гена MGMT у пациентов с глиомами степени 4 зачастую позволяет прогнозировать высокую устойчивость опухоли к темозоламиду — ключевому компоненту химиотерапии глиом — и может служить показанием к его отмене [6]. Напротив, наличие мутаций в генах ATRX и коделеции 1p/19q связано с более благоприятным прогнозом для пациента и лучшим ответом на химиотерапию [5, 7, 8].

В настоящий момент предпочтительным способом лечения заболевания и одновременно вариантом получения субстрата для генотипирования является тотальная резекция опухолевой ткани с последующей химио- и лучевой терапией [3]. В 50–70% случаев проведение данной операции невозможно ввиду характеристик опухоли или состояния пациента [3, 9]. Частичная резекция, а также биопсия новообразования позволяют получить ограниченное количество материала, что может препятствовать установлению генетического профиля опухоли. Более того, проведение нейрохирургической операции, в том числе в диагностических целях, например, для оценки прогрессирования опухоли в послеоперационном периоде, несёт опасность повреждения функционально значимых зон головного мозга и развития послеоперационных неврологических нарушений [3, 10].

Перспективной технологией для анализа генетических изменений глиом является жидкостная биопсия. Данный термин используется для обозначения ряда подходов к анализу опухолевых дериватов в биологических жидкостях организма, включающих в том числе внеклеточную опухолевую ДНК (воДНК), которая может служить высокоспецифичным маркёром новообразований [11]. Поскольку однонуклеотидные замены IDH1 R132H и pTERT C228T и C250T являются одними из самых распространённых и значимых генетических изменений глиом, также определяющих течение данного заболевания, их анализ с использованием цифровой капельной полимеразной цепной реакции (цкПЦР) может позволить оценивать наличие и, возможно, прогрессию злокачественного новообразования с высокой чувствительностью и специфичностью [3, 12]. Анализ данного маркёра в биологической жидкости позволяет следить за состоянием опухоли в динамике, а также предсказывать возникновение рецидивов [13, 14]. Классическим субстратом для данной технологии является кровь, однако ввиду наличия гематоэнцефалического барьера она содержит лишь около 6–7 нг/мл воДНК у пациентов с глиомами, что уменьшает чувствительность её анализа [15, 16]. В то же время концентрация данного маркёра в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) может превышать 70 нг/мл, что делает этот материал более предпочтительным для анализа [17]. Несмотря на это, концентрация воДНК в ЦСЖ в значительной мере зависит от степени злокачественности опухоли и её контакта с ликворными пространствами [18]. У пациентов с глиомами степени 1–3 по ВОЗ, располагающихся глубоко в белом веществе головного мозга, могут выявляться ограниченные количества данного маркёра, недостаточные для определения даже с помощью цкПЦР [18]. Для повышения чувствительности обнаружения исследуемых мутаций может применяться преамплификация, которая заключается в предварительном проведении ПЦР анализируемого участка. Значимость данного подхода была отмечена в исследовании М.А. Зайцевой и соавт., в котором преамплификация использовалась для повышения эффективности выявления соматического варианта H3 K27M с помощью цкПЦР в ЦСЖ пациентов с глиомами высокой степени злокачественности [18].

В статье J.B. Margolick и соавт. проведение преамплификации перед цкПЦР в диагностике цитомегаловируса позволило в 2 раза снизить минимальную концентрацию ДНК, необходимую для выявления возбудителя, без снижения специфичности анализа [19]. B.H. Diplas и соавт. также сообщают об успешном применении преамплификации для обнаружения мутаций IDH в образцах клеточных линий и замороженной ткани пациентов с диффузными глиомами [12].

В настоящий момент точный диагностический и прогностический потенциал жидкостной биопсии при глиомах неизвестен: данные исследований противоречивы. По имеющимся в литературе данным как чувствительность, так и специфичность указанной технологии могут варьировать от 50 до 100% [8]. Причиной этому является многообразие используемых маркёров, методов их анализа, а также различия в составах когорт участников исследования. На это, в частности, указывают метаанализы J. McMahon и соавт. и Y. Kang и соавт. [20, 21].

Цель исследования — оценить выявляемость и количественное содержание воДНК, несущей мутации IDH1 R132H и pTERT C228T и C250T в плазме и ЦСЖ пациентов с глиомами с помощью цкПЦР без и с использованием преамплификации.

Методы

Проведено наблюдательное одномоментное исследование госпитальных случаев пациентов с глиомами. Набор пациентов проводили однократно в период с апреля 2022 г. по июль 2023 г. в ФГБУ «Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова». В пилотное исследование были включены образцы плазмы и ЦСЖ 25 пациентов с впервые установленной глиомой (WHO grade 1–4).

Критериями включения являлись установленный диагноз глиомы и назначение операции по частичной или тотальной резекции опухоли.

Критерии исключения включали наличие иного активного злокачественного новообразования или иного злокачественного новообразования в анамнезе и проведение хирургического или химиотерапевтического лечения онкологического заболевания в анамнезе или на момент включения в исследование.

Клиническая информация о пациентах была получена из историй болезни пациентов и форм информированного добровольного согласия.

Морфологическую верификацию диагноза проводили с помощью гистологического исследования резецированного материала. Визуализацию и оценку пространственных параметров опухолей выполняли посредством компьютерной томографии, магнитно-резонансной томографии и позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии с 18FDG в соответствии с медицинскими показаниями. Все соответствующие данные были пересмотрены для целей исследования. Поиск мутаций производили в резекционном материале в коммерческой лаборатории методом NGS в рамках стандартного оказания медицинской помощи. Все лабораторные манипуляции проводили на базе университетской клиники Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Данное исследование носит пилотный характер. По его итогам планируется проведение открытого проспективного исследования на расширенной выборке пациентов.

Сбор и обработка биоматериала, выделение ДНК

У всех пациентов собраны образцы периферической венозной крови в объёме 10 мл в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой. Биоматериал собирали до проведения любых инвазивных диагностических процедур и лечения. Кровь хранили при температуре +4 °C не более 4 ч, после чего центрифугировали при 4000 g в течение 12 мин. Затем снова центрифугировали при 4000 g в течение 12 мин для осаждения оставшихся частиц. Плазма была перенесена в чистые пробирки объёмом 5 мл и заморожена при температуре −80 °С.

У пациентов интраоперационно произведён сбор ЦСЖ объёмом 2,5–5 мл, которая немедленно была заморожена при −80 °С. Забор происходил с помощью люмбальной пункции до повреждения ткани опухоли или головного мозга, чтобы избежать ложного завышения в крови и ЦСЖ воДНК.

После размораживания образцы плазмы и ЦСЖ тщательно перемешивали методом пульсирующего вортексирования. ДНК была выделена из 5 мл плазмы и 2,5–5 мл ЦСЖ набором Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Объём элюирования составил 100 мкл.

Анализ внеклеточной ДНК

Во всех образцах плазмы и ЦСЖ участников пилотного исследования анализировали воДНК с выявлением мутаций IDH1 R132H и pTERT C228T и C250T. Далее проводили проверку модифицированного протокола анализа воДНК с применением преамплификации для мутации IDH1 R132H и pTERT C228T и C250T.

Преамплификацию выполняли с использованием амплификатора CFX96 (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для преамплификации IDH1 использовали готовую смесь для ПЦР 5X qPCRmixHS (Evrogen, Россия), а также набор праймеров: прямой праймер 5ʹ-TATTGCCAACATGACTTA-3ʹ, обратный праймер 5ʹ-TGAAACAAATGTGGAAAT-3ʹ (концентрация в реакционной смеси — 0,4 мкМ).

Преамплификацию pTERT осуществляли с помощью готовой смеси для ПЦР 5X qPCRmixHS (UDG) (Евроген, Россия), а также праймеров: прямой праймер 5ʹ-AGCGCTGCCTGAAACTCG-3ʹ, обратный праймер 5ʹ-CCTGCCCCTTCACCTTCCAG-3ʹ (концентрация в реакционной смеси 0,4 мкМ). Поскольку анализируемая последовательность является GC-богатой областью ДНК, для проведения преамплификации использовали дополнительные реагенты, такие как диметилсульфоксид (ДМСО) (5% от объёма реакционной смеси), бетаин (1,25 моль/литр), формамид (5% от объёмной смеси), деаза-дезоксигуанозинтрифосфат (1% от объёма реакционной смеси), Encyclo буфер для амплификации GC-богатой ДНК (Евроген, Россия), а также комбинации ДМСО + формамид, ДМСО + бетаин. Более подробные составы реакционных смесей для преамплификации pTERT изложены в табл. А1.

Оптимальная температура отжига праймеров была выявлена в результате серии экспериментов с контрольными образцами ДНК и составила 57 °С для IDH1 и 54 °С для pTERT. Протоколы преамплификации представлены в табл. А2 и А3.

Перед проведением последующего анализа ДНК получившуюся смесь разбавляли в соотношении 1:1 с помощью буфера ТЕ.

Анализ общей внеклеточной ДНК (вкДНК) до и после преамплификации производили с помощью цифровой капельной ПЦР (цкПЦР). Генерацию капель и считывание проводили с использованием автоматизированной системы для цкПЦР QX200 AutoDG ddPCR (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Обнаружение мутантного аллеля IDH1 проводили с использованием набора ddPCR™ Mutation Assay: IDH1 p.R132H (BioRad, США). Анализ цкПЦР мутаций pTERT выполняли с использованием праймеров: 5ʹ-AGCGCTGCCTGAAACTCG-3ʹ, обратный праймер 5ʹ-CCTGCCCCTTCACCTTCCAG-3ʹ, — а также LNA-зондов на аллель дикого типа HEX-CCCC+C+T+CCGG-BHQ-1 и на мутантный аллель (подходит для обеих замен) 6-FAM-CCC+C+T+T+CCGG-BHQ-1 [22]. Схема последовательности нуклеотидов праймеров и зондов указана на рис. Б1.

Концентрация праймеров в реакционной смеси составила 0,9 мкМ, зондов — 0,25 мкМ. Ввод раствора ДНК в конечную реакционную смесь ddPCR был установлен на 8,8 мкл в лунку для определения концентрации мутации IDH1 R132H и 9,9 мкл для определения концентраций копий мутантных pTERT C228T и C250T. Условия термоциклирования были установлены в соответствии с протоколами производителей и указаны в табл. А4 и А5.

Общее количество вкДНК определяли как сумму количества аллелей мутантного и дикого типа IDH1. Результаты цифровой капельной ПЦР представлены как в абсолютном виде (число копий на 1 мл биоматериала), так и в виде фракции мутантных аллелей (ФМА) ДНК (уровень воДНК/общий уровень вкДНК, %).

Определение концентрации ДНК в биологической жидкости производили по формуле:

С_мл = С_мкл × 2200/(V_суб × V_ДНК),

где С_мл — концентрация ДНК в плазме/ЦСЖ, копии/мл; С_мкл — концентрация ДНК в конечной реакционной смеси, измеренная в процессе цкПЦР, копии/мкл; V_суб — объём субстрата, из которого произведено выделение ДНК, мл; V_ДНК — объём ДНК в конечной реакционной смеси для цкПЦР, мкл.

Поскольку преамплификация ведёт к неравномерному изменению числа ДНК, было принято решение не экстраполировать концентрацию ДНК в реакционной смеси на объём субстрата.

Пороговое значение для ложноположительных сигналов воДНК по мутантному аллелю установлено в серии цкПЦР с анализом образцов ДНК дикого типа и отрицательного контроля без матрицы.

Статистический анализ

Статистическая обработка данных произведена с использованием пакета статистических программ IBM SPSS Statistics 26.0 (IBM Corp., США).

Нормальность распределения данных в каждой группе оценена при помощи критерия Шапиро–Уилка. Из-за отсутствия нормального распределения использовали критерии Манна–Уитни и Уилкоксона (для парных данных). Для определения корреляционных связей применяли критерий ранговой корреляции Спирмена. Количественные данные представлены в виде медиана (1-й квартиль; 3-й квартиль). Результаты статистического анализа считали значимыми при p <0,05.

Результаты

Характеристики пациентов

В исследование были включены образцы плазмы и ЦСЖ 25 пациентов с глиомами. Средний возраст пациентов на момент 1-го сбора крови составил 46,6 (28–71) года; соотношение полов — 12 мужчин и 13 женщин. В табл. 1 приведены клинические характеристики проанализированной когорты.

 

Таблица 1. Демографические и клинические характеристики участников исследования

Table 1. Demographic and clinical characteristics of study participants

Параметры	Величины
Возраст, годы	46,6 (28–71)1
Пол, мужской/женский, n (%)	12/13 (48/52)
ИМТ, кг/м2	25,85 (17,04–32,45)1
Степень злокачественности опухоли по ВОЗ:
1, n	1
2, n	1
3, n	9
4, n	14
Локализация опухоли, n:
лобная доля	14
теменная доля	12
височная доля	10
островковая доля	6
затылочная доля	4
таламус	1
Объём опухоли, см3:
<50	13
50–100	4
100–150	6
>150	1
Накопление контрастного вещества:
нет, n	10/25
умеренное/неравномерное, n	7/25
интенсивное, n	1/25
кольцевидное, n	7/25
IDH1 R132H	11

Примечание. ¹ Данные представлены в виде: среднее арифметическое (диапазон). ИМТ — индекс массы тела; ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения.

 

Мутационный статус IDH1 в тканях был установлен у 18/25 пациентов, включённых в исследование: у 9/11 пациентов со степенью злокачественности 1–3 по ВОЗ и у 9/14 пациентов со степенью 4. Среди пациентов с глиомами 1–3-й степени 7/9 (77,8%) были носителями мутации IDH1 R132H, в то время как лишь 4/9 (44,4%) пациентов со степенью злокачественности 4 по данным секвенирования имели данную мутацию. Более подробные данные представлены в табл. А6.

Диагностическая эффективность анализа без преамплификации

Анализ вкДНК из плазмы выполнен у 25 участников исследования; анализ ДНК из ЦСЖ — у 24 (образец ЦСЖ одного из участников исследования не был доступен). В серии экспериментов с использованием образцов контрольной ДНК дикого типа и контроля без матрицы были установлены пороговые значения ложноположительных сигналов; концентрация вкДНК приведена в виде количества копий на миллилитр субстрата. Подробные результаты анализа доступны в табл. А6.

По результатам анализа образцов без применения преамплификации концентрация общей вкДНК в ЦСЖ и плазме составила 1437,5 (661,8; 2320) против 1410,66 (915,6; 4890,11) копии/мл соответственно. При этом значимые различия между уровнями общей вкДНК в парных образцах ЦСЖ и плазмы отсутствовали (p >0,05). На рис. 1 представлены результаты сравнения уровней общей вкДНК в парных образцах ЦСЖ и плазмы участников пилотного исследования. Наибольшим значением уровня общей вкДНК для ЦСЖ было 312 15,1 копии/мл, тогда как для плазмы — 145 038,04 копий/мл.

 

Рис. 1. Сравнение уровней внеклеточной ДНК в цереброспинальной жидкости и плазме пациентов с глиомами. ЦСЖ — цереброспинальная жидкость. Выбросы 312 15,1 и 145 038,04 копий/мл для цереброспинальной жидкости и плазмы соответственно были скрыты для сохранения пропорций рисунка. р-значение определено методом Уилкоксона.

Fig. 1. Comparison of extracellular DNA levels in the cerebrospinal fluid and plasma of patients with glioma. CSF, cerebrospinal fluid. Outliers of 31,215.1 and 145,038.04 copies/mL for cerebrospinal fluid and plasma, respectively, were excluded to maintain figure proportions. P-value was calculated using the Wilcoxon test.

 

В плазме воДНК, несущая мутации IDH1 R132H и pTERT C228T/C250T, не была выявлена ни в одном из образцов. В ЦСЖ без применения преамплификации обнаружена воДНК, несущая мутации IDH1 R132H (три образца) и pTERT C228Т (четыре образца), но не pTERT C250T. Мутация IDH1 R132H зафиксирована в 1/7 образцов пациентов с глиомами степени 1–3 по ВОЗ и в 2/4 образцов пациентов с глиомами степени 4, которые, согласно анализу биопсийного материала, также были положительными по данной мутации. Случаев ложноположительного выявления мутации при её отсутствии в ткани по данным секвенирования не было обнаружено. Все четыре мутации pTERT выявлены в ЦСЖ пациентов с глиомами степени злокачественности 4, при этом ни один из образцов этих пациентов, по данным исследования биопсийного материала, не содержал мутацию IDH1 R132H. Концентрация воДНК из ЦСЖ, содержащей мутации pTERT и IDH1, составила 195,11 (32,43; 276,45) копий/мл, ФМА — 4,04 (3,29; 9,43) % (рис. Б2). Образцов с одновременным присутствием обоих мутантных аллелей выявлено не было. В табл. А6 представлены значения уровней и ФМА для вышеуказанных положительных образцов.

Диагностическая эффективность анализа после преамплификации

Несмотря на использование широкого ряда реагентов для амплификации GC-богатых последовательностей, преамплификация ДНК, содержащей участки pTERT, характеризовалась отсутствием продукта. В ходе исследования были протестированы различные протоколы, обычно применяемые в подобных ситуациях (в том числе с добавлением бетаина, ДМСО, 7-деаза-дезоксигуанозинтрифосфата, уридинтрифосфата и др.), однако они не дали ожидаемого результата (табл. А1) [23]. Следует отметить, что даже при проведении цкПЦР амплификация данного участка была затруднена и происходила только при использовании ПЦР-смеси, содержащей уридинтрифосфат. Таким образом, далее в данном разделе представлены результаты преамплификации только для ДНК из ЦСЖ, содержащей мутации гена IDH1.

В ходе экспериментов с применением преамплификации установлено, что в образцах ДНК дикого типа и отрицательного контроля (без матрицы) не появляются ложноположительные капли эмульсии при проведении цкПЦР. На рис. 2, a, b представлен пример 2D-графиков с результатами цкПЦР одного и того же образца до преамплификации и после.

 

Рис. 2. Сравнение уровней внеклеточной ДНК в цереброспинальной жидкости и плазме пациентов с глиомами до преамплификации (a) и после проведения преамплификации (b). ЦСЖ — цереброспинальная жидкость. Выбросы 312 15,1 и 145 038,04 копий/мл для цереброспинальной жидкости и плазмы соответственно были скрыты для сохранения пропорций рисунка. р-значение определено методом Уилкоксона.

Fig. 2. Comparison of extracellular DNA levels in the cerebrospinal fluid and plasma of patients with glioma before (a) and after (b) pre-amplification. CSF, cerebrospinal fluid. Outliers of 31,215.1 and 145,038.04 copies/mL for cerebrospinal fluid and plasma, respectively, were excluded to maintain figure proportions. P-value was calculated using the Wilcoxon test.

 

Поскольку после проведения преамплификации точное установление количества копий ДНК в первоначальном материале затруднено, уровень внеклеточной ДНК далее указан в копиях на микролитр реакционной смеси.

Ожидаемо после преамплификации уровни общей вкДНК в образцах из ЦСЖ оказались статистически значимо выше, чем до преамплификации [1953,96 (627,93; 3331,3) против 23,7 (12,9; 36,3) копий/мкл реакционной смеси соответственно, р <0,001, рис. Б3]. Таким образом, в среднем при преамплификации уровень вкДНК из ЦСЖ в конечной реакционной смеси увеличился в 91,06 (74,77; 123,91) раза. Уровни мишеней после преамплификации статистически значимо с умеренно высокой силой коррелировали с таковыми при отсутствии преамплификации (r=0,746; p <0,001), что представлено на рис. 3. Кроме того, произошло увеличение содержания воДНК из ЦСЖ в трёх образцах с выявленной на предыдущем этапе мутацией IDH1 R132H с 0,515 по 3,9 (в 7,6 раза), с 0,302 по 4,62 (в 15,3 раза) и с 5,840 по 126,35 (в 21,6 раза) копий на 1 мкл реакционной смеси. Однако ФМА IDH1 R132H в данных образцах снизилась с 11,55 до 3,64%, с 4,71 до 4% и с 3,03 до 2,06%.

 

Рис. 3. Диаграмма рассеяния уровней внеклеточной ДНК до и после преамплификации в цереброспинальной жидкости пациентов с глиомами. На оси абсцисс указано значение уровня общей внеклеточной ДНК в цереброспинальной жидкости до преамплификации (копии/мкл), а на оси ординат указано значение уровня общей внеклеточной ДНК в цереброспинальной жидкости после преамплификации (копии/мкл). ЦСЖ — цереброспинальная жидкость. Данные представлены в виде копий на 1 мкл реакционной смеси. р-значение определено методом Спирмена.

Fig. 3. Scatter plot of extracellular DNA levels before and after pre-amplification in the cerebrospinal fluid of patients with glioma. The x-axis shows the total extracellular DNA concentration in cerebrospinal fluid before pre-amplification (copies/μL); the y-axis shows the total extracellular DNA concentration after pre-amplification (copies/μL). CSF, cerebrospinal fluid. Data are presented as copies per 1 μL of reaction mixture. P-value was calculated using Spearman’s test.

 

В целом после проведения преамплификации частота выявления воДНК из ЦСЖ, несущей мутацию IDH1 R132H, выросла с 1/7 образцов пациентов с глиомами степени 1–3 по ВОЗ и 2/4 образцов пациентов с глиомами степени 4 до 4/7 и 3/4 соответственно. Кроме того, у одного пациента с глиомой степени 1 и ещё у одного со степенью 4 в ЦСЖ обнаружена мутация IDH1 R132H, не выявленная по результатам исследования биопсийного материала. Также у одного пациента с глиомой степени 4 в ЦСЖ зафиксирована мутация IDH1 R132H, однако не было данных исследования биопсийного материала. Таким образом, частота выявления воДНК, несущей мутацию IDH1 R132H, выросла с 2 из 24 до 10 из 24 (табл. А6). Среди всех образцов с обнаруженной воДНК из ЦСЖ, несущей мутацию IDH1 R132H, её уровень составил 0,54 (0,3; 3,19) копий/мкл, а ФМА — 0,042 (0,031; 0,108) %.

Связь уровней вкДНК с клинико-демографическими характеристиками пациентов

При статистической обработке результатов цкПЦР всех участников исследования до и после преамплификации взаимосвязи между уровнями общей вкДНК в ЦСЖ и плазме с клинико-демографическими характеристиками пациентов (возраст, пол, рост, вес, ИМТ) были статистически незначимы (p >0,05). Диаграммы рассеяния с указанием числовых значений коэффициентов корреляции (R), а также р-значений для каждой из приведённых взаимосвязей указаны на рис. Б4. Несмотря на то что у когорт пациентов, сгруппированных по степени злокачественности опухоли и характеру накопления контраста, наблюдается рост внеклеточной ДНК, значимая связь между этим показателем и указанными характеристиками опухоли отсутствует. Также не обнаружена связь между локализацией опухоли и уровнем вкДНК. Лишь между уровнем общей вкДНК в плазме и характером накопления контраста опухолью наблюдается связь (р=0,034), что показано на рис. 4.

 

Рис. 4. Графики уровней общей внеклеточной ДНК в биологических жидкостях пациентов, разделённых на группы: a — уровень общей внеклеточной ДНК в плазме всех пациентов по группам по накоплению контраста; b — уровень общей внеклеточной ДНК в цереброспинальной жидкости пациентов с выявленной внеклеточной опухолевой ДНК, сгруппированных по степени злокачественности глиом; c — уровень общей внеклеточной ДНК в плазме пациентов с выявленной внеклеточной опухолевой ДНК, сгруппированных по характеру накопления контраста. ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения. На рисунке a выбросы 312 15,1 и 145 038,04 копий/мл для цереброспинальной жидкости и плазмы соответственно были скрыты для сохранения пропорций рисунка. р-значение определено методом Краскела–Уоллиса.

Fig. 4. Graphs of total extracellular DNA levels in biological fluids of patients stratified into groups: a, total extracellular DNA levels in plasma across patient groups according to contrast enhancement pattern; b, total extracellular DNA levels in cerebrospinal fluid of patients with detected extracellular tumor DNA, grouped by glioma grade; and c, total extracellular DNA levels in plasma of patients with detected extracellular tumor DNA, grouped by contrast enhancement pattern. WHO, World Health Organization. a, outliers of 31,215.1 and 145,038.04 copies/mL for cerebrospinal fluid and plasma, respectively, were excluded to maintain figure proportions. P-value was determined using the Kruskal–Wallis test.

 

При обработке результатов пациентов с выявленной мутантной ДНК как до, так и после преамплификации, содержащей мутации обоих генов, после исключения образцов с предположительно ложноположительными результатами не было отмечено взаимосвязи между уровнем вкДНК в плазме и ЦСЖ с возрастом, полом, ИМТ пациента, а также локализацией опухоли. Однако выявлена связь между общей вкДНК в ЦСЖ до преамплификации и степенью злокачественности опухоли (р=0,024), а также общей вкДНК в плазме с характером накопления контраста (р=0,046) (рис. 4). При анализе результатов пациентов с выявленной мутантной ДНК в плазме и ЦСЖ до и после преамплификации после исключения пациентов с предположительно ложноположительными результатами, а также образцов с отрицательными мутантными аллелями IDH1 взаимосвязи между абсолютным уровнем воДНК и ФМА с возрастом, полом, ИМТ пациента также были статистически незначимы (р >0,05). Диаграммы рассеяния с указанием числовых значений коэффициентов корреляции (R), а также р-значений для каждой из приведённых взаимосвязей указаны на рис. Б5.

Обсуждение

В соответствии с полученными данными анализа без преамплификации уровень общей вкДНК в плазме в целом не отличался от такового в ЦСЖ. Применение преамплификации IDH1 ожидаемо привело к повышению уровня как общей вкДНК, так и воДНК. Несмотря на то что 10 циклов преамплификации должны увеличить содержание ампликона в 2¹⁰ (т. е. примерно в тысячу раз), после проведения данной процедуры уровень общей вкДНК увеличивался лишь в 91,06 (74,77; 123,91) раза. Такое отклонение указывает на то, что на каждом цикле прирост ДНК составлял лишь около 57% от ожидаемого. Причиной этому могут быть как неэффективность отжига праймеров, так и наличие в смеси ингибиторов ПЦР [24]. Как можно заметить, прирост воДНК оказался ещё меньше (до 21,6 раза), что подтверждается снижением ФМА в образцах с выявленной мутацией IDH1 до и после преамплификации. Вероятно, преамплификация непосредственно мутантного аллеля происходит менее эффективно вследствие эффекта конкуренции праймеров с избытком аллеля дикого типа за комплементарное связывание с мутантным ампликоном, находящимся в меньшинстве [25]. Решением данной проблемы может быть использование различных методов, таких как аллель-специфическая ПЦР, подавление амплификации ДНК дикого типа селективными агентами, анализ плавления с высоким разрешением и т. д. [25, 26]. Впрочем, данных сравнения всего двух образцов недостаточно для того, чтобы сделать окончательный вывод об изменении соотношения опухолевой ДНК и ДНК дикого типа в реакционной смеси во время преамплификации.

В то время как по результатам цкПЦР без преамплификации ни один образец плазмы не содержал воДНК, в образцах ЦСЖ чувствительность и специфичность выявления мутации IDH R132H с помощью жидкостной биопсии составили 14,3 и 100% для пациентов с глиомами степени 1–3 по ВОЗ и 50 и 100% для пациентов с глиомами степени 4. Стоит отметить, что при проведении цкПЦР без этапа преамплификации уровни мутантных аллелей как IDH1, так и pTERT в целом были крайне низкими. В некоторых случаях по результатам цкПЦР выявлялось всего несколько капель эмульсии, положительных по мутантной ДНК. Таким образом, работа проводилась на нижнем пороге чувствительности системы, составлявшем три капли с мутантной ДНК, что может объяснять низкую частоту выявления мутантного аллеля в исследуемой выборке.

После преамплификации чувствительность и специфичность выявления IDH R132H составили 57,1 и 50% для пациентов с глиомами степени 1–3 по ВОЗ и 75 и 80% для пациентов с глиомами степени 4. Как уже было отмечено, концентрация воДНК в ЦСЖ может в значительной мере зависеть от степени злокачественности глиомы и её локализации в головном мозге. Мутантная ДНК значительно чаще выявляется в биологических жидкостях пациентов с глиомами степени 3 и 4 по ВОЗ: глиобластомами, анапластическими астроцитомами и т. д., а также среди опухолей, локализованных близко к ликворным пространствам, что может объяснять разницу в чувствительности жидкостной биопсии между группами пациентов в настоящем исследовании [8, 17, 27]. Более того, ликвор, собранный из желудочков головного мозга, находящихся ближе к опухоли, может содержать значительно большее количество воДНК по сравнению с материалом, полученным с помощью люмбальной пункции [28].

Помимо этого, в четырёх образцах ЦСЖ пациентов с глиомами степени 4, которые по результатам исследования биопсийного материала и жидкостной биопсии не содержали мутации IDH1, была обнаружена мутация pTERT. Вероятно, это объясняется тем, что среди глиом 4-й степени злокачественности преобладают глиобластомы, характеризующиеся отсутствием мутаций IDH1, но присутствием мутантных аллелей pTERT. В то же время глиомы степени злокачественности 2 и 3 примерно в 50% случаев представляют собой астроцитомы, которые являются положительными по мутации IDH1, но не содержат мутаций pTERT [1, 3, 4].

По данным литературы, чувствительность и специфичность жидкостной биопсии в выявлении мутаций IDH1 и pTERT как в плазме, так и в ЦСЖ различными методами составляет 50–100% и 80–100% соответственно [27, 29, 30]. Если чувствительность выявления воДНК в нашем исследовании среди пациентов как со степенью глиом 1–3, так и со степенью 4 входит в этот диапазон, то специфичность среди пациентов с глиомами степени 1–3 оказывается значительно ниже. Впрочем, следует учитывать, что данные результаты находятся под влиянием ограниченного размера выборки (в данном исследовании были проанализированы образцы всего от 11 пациентов с глиомами степени злокачественности 1–3, однако только у двух из них было выявлено отсутствие мутаций IDH1 R132H).

Выявление мутации IDH1 R132H в ЦСЖ после преамплификации, но не по данным секвенирования, может объясняться как ложноположительным результатом (который, однако, не наблюдался при анализе образцов дикого типа), так и наличием у пациента неизвестных локальных метастазов или низкой частотой опухолевого аллеля в ткани, недостаточной для детекции методом секвенирования. Например, S. Xie и соавт. с помощью жидкостной биопсии обнаружили амплификации HER2 в образцах плазмы у 28% пациенток с раком молочной железы, ранее классифицированных как HER2-отрицательные с помощью цкПЦР биопсийного материала [31]. Также S. Crucitta и соавт. сообщают о том, что у 7,3% пациентов из исследуемой когорты мутация IDH R132H была обнаружена в плазме с помощью цкПЦР, но не в опухолевой ткани путём секвенирования по Сэнгеру [29].

Несмотря на то что в цкПЦР и при преамплификации pTERT использовались одни и те же праймеры, попытки преамплификации данного гена, в отличие от IDH1, характеризовались отсутствием продукта. Это может объясняться сложной структурой промотора данного гена, богатого GC-повторами и потому склонного к образованию квадруплексных структур, ингибирующих Taq-полимеразу [32]. Однако остаётся неясным, почему при проведении ПЦР в эмульсии амплификация проходила успешно, в отличие от попыток её выполнения в некомпартментализированном объёме реакционной смеси при преамплификации [24].

После статистической обработки результатов анализа наблюдается связь между уровнями как вкДНК, так и воДНК, с одной стороны, и объёмом, степенью злокачественности и характером накопления контраста опухолью — с другой. Отсутствие статистической значимости между уровнем мутантной ДНК и ДНК дикого типа в общей выборке пациентов и объёмом новообразования, скорее всего, объясняется ограниченным размером выборки, поскольку в аналогичных исследованиях между указанными показателями наблюдалась статистически значимая зависимость [30, 33].

В то же время в общей выборке пациентов и среди пациентов с выявленной воДНК (содержащей мутантные аллели IDH1 и pTERT) наблюдается статистически значимая зависимость между вкДНК в плазме и характером накопления контраста. Это может свидетельствовать о структуре сосудов в местах опухолевого роста. Так, у 8 из 12 пациентов с глиомами степени злокачественности 1–3 накопления контраста не происходило, в то время как у пациентов с глиомами степени 4 накопление контраста приобретало кольцевидную форму, которая может свидетельствовать о более агрессивном опухолевом росте [34]. Кроме того, в когорте пациентов с выявленной воДНК, сгруппированных по степени злокачественности глиом, наблюдается статистически значимая разница в уровне вкДНК.

Таким образом, жидкостная биопсия плазмы и ЦСЖ является перспективной технологией для диагностики и генотипирования глиом. К сожалению, данный метод исследования всё ещё обладает ограниченными чувствительностью и специфичностью в выявлении воДНК, особенно в образцах пациентов с глиомами низкой степени злокачественности, и в данный момент не может стать заменой генотипированию опухолевой ткани. Кроме того, несмотря на важную роль молекулярно-генетического исследования опухолей центральной нервной системы первостепенное значение в их диагностике по-прежнему принадлежит гистопатологическому исследованию. Тем не менее жидкостная биопсия предоставляет уникальные прогностические возможности, представляющие значительный научный и клинический интерес, и служит стимулом для дальнейшего развития данной технологии.

Ограничения

Существует несколько ограничений, влияющих на результаты представленной работы. Во-первых, исследование носило пилотный характер, вследствие чего размер выборки был ограничен 25 пациентами, что снижает статистическую значимость наблюдаемых различий. Во-вторых, данные о наличии мутаций гена IDH1 по результатам секвенирования были доступны лишь для 17/24 пациентов, а информация о мутациях pTERT отсутствовала, что затрудняет точное определение чувствительности и специфичности проведённого анализа. Кроме того, в рамках пилотного исследования доступ к образцам ткани был ограничен, ввиду чего валидация происходила только при сравнении с данными секвенирования. Стоит отметить, что NGS является одобренным методом генотипирования резекционного материала опухолей центральной нервной системы, и его чувствительность в целом сопоставима для таковой у цкПЦР [3, 35]. Несмотря на это, протокол основного исследования включает получение резекционного материала и его анализ с помощью цкПЦР для валидации результатов NGS.

Заключение

В настоящем исследовании было проведено определение чувствительности и специфичности жидкостной биопсии плазмы и ЦСЖ у пациентов с глиомами. В качестве метода анализа использовали цкПЦР с выявлением мутаций генов IDH1 и pTERT без проведения и с проведением предварительной амплификации. Несмотря на то что данная технология обладает ограниченными чувствительностью и специфичностью в выявлении глиом, особенно низкой степени злокачественности, она позволяет оценивать важные характеристики опухоли (такие как размер новообразования и характер накопления контраста), что может быть полезно для выбора терапевтической тактики. Кроме того, развитие данной технологии может предоставить дополнительные возможности неинвазивного наблюдения за состоянием опухоли и прогнозирования её роста.

Дополнительная информация

Приложение А. Таблицы А1–A6. DOI: 10.17816/KMJ679633-4384284

Приложение B. Рисунки B1–B5. DOI: 10.17816/KMJ679633-4384285

Вклад авторов. Р.Т.И. — валидация, проведение исследования, анализ данных, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи; Д.М. — определение концепции, разработка методологии, валидация, проведение исследования, анализ данных, пересмотр и редактирование рукописи, администрирование проекта, привлечение финансирования; С.Л.М. — пересмотр и редактирование рукописи, администрирование проекта; А.И.М. — разработка методологии, проведение исследования, анализ, пересмотр и редактирование рукописи; З.А.А. — определение концепции, разработка методологии, пересмотр и редактирование рукописи, администрирование проекта. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом Национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова (протокол № 3 от 16.03.2022). Все участники предоставили подписанные формы добровольного согласия.

Согласие на публикацию. Все представленные сведения обезличены, фотографии не публикуются.

Источники финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке государственного задания «Разработка инновационных лабораторных технологий, включая молекулярно-генетические, для диагностики заболеваний», регистрационный № 123-032800010-0 от 2024 года. Российская Федерация не участвовала в организации, планировании и проведении исследования, сборе, хранении, анализе и интерпретации данных, подготовке рукописи и принятии решения о её публикации, а также в осуществлении надзора за исследованием. Финансирующие организации не устанавливали ограничений на использование данных и распространение результатов исследования.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Заявление об оригинальности. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье и в приложениях к ней.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

Additional information

Supplement А: Tables А1–A6. DOI: 10.17816/KMJ679633-4384284

Supplement B: Figures B1–B5. DOI: 10.17816/KMJ679633-4384285

Author contributions: R.T.I.: validation, investigation, formal analysis, writing—original draft, writing—review & editing; D.M.: conceptualization, methodology, validation, investigation, formal analysis, writing—review & editing, project administration, funding acquisition; S.L.M.: writing—review & editing, project administration; A.I.M.: methodology, investigation, formal analysis, writing—review & editing; Z.A.A.: conceptualization, methodology, writing—review & editing, project administration. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study protocol was approved by the local Ethics Committee of the N.I. Pirogov National Medical and Surgical Center (minutes No. 3, dated March 16, 2022). Written informed consents were obtained from all the participants.

Informed consent: All presented data are anonymized; no photographs are published.

Funding sources: The study was financially supported by the state assignment Development of Innovative Laboratory Technologies, Including Molecular Genetic Ones, for Disease Diagnostics (Registration No. 123-032800010-0, 2024). The Russian Federation had no involvement in the design, planning, or conduct of the study; data collection, storage, analysis, or interpretation; manuscript preparation; publication decisions; or study oversight. The funding organizations imposed no restrictions on data utilization or the dissemination of study findings.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved two external reviewers, a member of the Editorial Board, and the in-house science editor.

About the authors

Tagir I. Rakhmatullin

Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: tagir.rakhmatullin@internet.ru
ORCID iD: 0000-0002-4601-3478
SPIN-code: 7068-1678

intern-researcher

Russian Federation, Moscow

Mark Jain

Lomonosov Moscow State University

Email: jain-mark@outlook.com
ORCID iD: 0000-0002-6594-8113
SPIN-code: 3783-4441

Cand. Sci. (Biology), senior research associate

Russian Federation, Moscow

Larisa M. Samokhodskaya

Lomonosov Moscow State University

Email: slm@fbm.msu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6734-3989
SPIN-code: 5404-6202

MD, Cand. Sci. (Medicine), assistant professor

Russian Federation, Moscow

Ivan M. Alekseev

National Medical and Surgical Center named after N.I. Pirogov

Email: alexeev.im@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8107-3065
SPIN-code: 9947-1988

neurosurgeon

Russian Federation, Moscow

Andrey A. Zuev

National Medical and Surgical Center named after N.I. Pirogov

Email: mosbrain@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2974-1462
SPIN-code: 9377-4574

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files