Transgenic Lines of Human Induced Pluripotent Stem Cells ICGi022-A-6 and ICGi022-A-7 with Doxycycline-Inducible Variants of Programmable Nuclease AsCas12a

S. V. Pavlova; Павлова С. В.; K. R. Valetdinova; Валетдинова К. Р.; T. B. Malankhanova; Маланханова Т. Б.; D. E. Polivtsev; Поливцев Д. Е.; A. A. Malahova; Малахова А. А.; E. V. Grigor’eva; Григорьева Е. В.; A. I. Shevchenko; Шевченко А. И.; S. M. Zakian; Закиян С. М.; S. P. Medvedev; Медведев С. П.

doi:10.31857/S047514502306006X

Трансгенные линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека ICGi022-A-6 и ICGi022-A-7 с доксициклин-управляемыми вариантами программируемой нуклеазы AsCas12a

Авторы: Павлова С.В.¹^,2^,3, Валетдинова К.Р.¹, Маланханова Т.Б.¹, Поливцев Д.Е.¹^,4, Малахова А.А.¹^,2^,3, Григорьева Е.В.¹^,2^,3, Шевченко А.И.¹^,2^,3, Закиян С.М.¹^,2^,3, Медведев С.П.¹^,2^,3
Учреждения:
1. ФГБНУ “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук”
2. ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения Российской Федерации”
3. ФГБУН “Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук”
4. ФГАОУВО “Новосибирский национальный исследовательский государственный университет”
Выпуск: Том 54, № 6 (2023)
Страницы: 415-428
Раздел: КОЛЛЕКЦИЯ ЛИНИЙ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
URL: https://kazanmedjournal.ru/0475-1450/article/view/669915
DOI: https://doi.org/10.31857/S047514502306006X
EDN: https://elibrary.ru/GESSIW
ID: 669915

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Редактирование геномов плюрипотентных стволовых клеток человека с применением программируемых нуклеаз позволяет создавать модели наследственных патологий с помощью направленного трансгенеза, нокаута генов и замены отдельных нуклеотидов в последовательностях ДНК. С использованием CRISPR/SpCas9-опосредованной гомологичной рекомбинации в локусе AAVS1 были получены клоны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека ICGi022-A (Malakhova et al., 2020), которые несут трансгены двух вариантов нуклеазы AsCas12a (также известной как AsCpf1), распознающих разные консенсусы PAM (ICGi022-A-6 (AsCas12a, PAM 5'-TTTV-3') и ICGi022-A-7 (AsCas12a, PAM 5'-TYCV-3')), и трансген обратного доксициклин-зависимого трансактиватора M2rtTA. С помощью Вестерн-блот анализа было показано, что добавление в культуральную среду доксициклина вызывает активацию экспрессии белков AsCas12a(TTTV) и AsCas12a(TYCV). Полученные трансгенные клоны ИПСК были подвергнуты молекулярно-генетическому и цитогенетическому анализу. С помощью количественной ПЦР и иммуноцитохимического анализа было показано, что в них наблюдается высокий уровень экспрессии мРНК генов-маркеров плюрипотентных клеток – OCT4, NANOG и SOX2, а также специфичная экспрессия белков-маркеров – OCT4, SOX2, SSEA-4 и TRA-1-60. Кроме того, с помощью метода спонтанной дифференцировки ИПСК в эмбриоидных тельцах, было установлено, что трансгенные клоны могут давать производные всех трех примитивных зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы. Цитогенетический анализ показал, что трансгенные клоны ИПСК имеют нормальный кариотип 46,XX.

Ключевые слова

индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), трансгенез, система CRISPR/Cas9, нуклеаза AsCas12a (AsCpf1), изогенные клеточные линии

Об авторах

С. В. Павлова

ФГБНУ “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук”; ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения Российской Федерации”; ФГБУН “Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения
Российской академии наук”

Email: medvedev@bionet.nsc.ru
Россия, 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 10; Россия, 630055, Новосибирск, ул. Речкуновская, 15; Россия, 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 8

Список литературы

Медведев С.П., Маланханова Т.Б., Валетдинова К.Р., Закиян С.М. Создание и исследование клеточных моделей наследственных нейродегенеративных заболеваний с помощью направленного редактирования геномов // Нейрохимия. 2021. Т. 38. № 4. С. 313–319.
Устьянцева Е.И., Медведев С.П., Ветчинова А.С. и др. Платформа для исследования механизмов нейродегенерации с помощью генетически кодируемых биосенсоров // Биохимия. 2019. Т. 84. № 3. С. 423–435.
Cowan C.A., Klimanskaya I., McMahon J. et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts // N. Engl. J. Med. 2004. V. 350. № 13. P. 1353–1356.
DeKelver R.C., Choi V.M., Moehle E.A. et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome // Genome Res. 2010. V. 20. № 8. P. 1133–1142.
Gao L., Cox D.B.T., Yan W.X. et al. Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities // Nat. Biotechnol. 2017. V. 35. № 8. P. 789–792.
Grigor’eva E.V., Malankhanova T.B., Surumbayeva A. et al. Generation of GABAergic striatal neurons by a novel iPSC differentiation protocol enabling scalability and cryopreservation of progenitor cells // Cytotechnology. 2020. V. 72. P. 649–663.
Hellemans J., Mortier G., De Paepe A. et al. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data // Genome Biol. 2008. V. 8. P. R19.
Kim D., Kim J., Hur J.K. et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 8. P. 863–868.
Kleinstiver B.P., Tsai S.Q., Prew M.S. et al. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 8. P. 869–874.
Malakhova A.A., Grigor’eva E.V., Pavlova S.V. et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines ICGi021-A and ICGi022-A from peripheral blood mononuclear cells of two healthy individuals from Siberian population // Stem Cell Res. 2020. V. 48. P. 101952.
Ran F.A., Hsu P.D., Wright J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system // Nat. Protoc. 2013. V. 8. № 11. P. 2281–2308.
Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system // Cell. 2015. V. 163. № 3. P. 759–771.