Изолированный из генома промотор гена FOS человека гиперактивирован и малочувствителен к изменению Na+i/K+i-соотношения

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Показано, что изменения внутриклеточных концентраций ионов Na+ и K+ влияют на экспрессию гена FOS. В данной работе мы получили генетическую конструкцию, кодирующую TurboGFP-dest1 под управлением промотора FOS человека (−549; +155), и оценили изменение экспрессии TurboGFP-dest1 при воздействии одновалентных катионов металлов в клетках HEK 293T. Амплификация последовательности промотора FOS с использованием геномной ДНК человека в качестве матрицы проходила успешно только в присутствии ионов Li+. Инкубация клеток в присутствии уабаина и в среде, где ионы Na+ были полностью замещены ионами Li+, вызывала накопление в клетках Na+ и Li+ соответственно. Кроме того, эти воздействия приводили к увеличению уровня мРНК эндогенного FOS и средней интенсивности флуоресценции TurboGFP-dest1 в трансфицированных клетках. Количество мРНК TurboGFP-dest1 было значительно больше по сравнению с мРНК эндогенного FOS и слабо изменялось под действием одновалентных катионов металлов.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. М. Горбунов

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: klimanova.ea@yandex.ru

Биологический факультет, кафедра биохимии

Россия, 119234, Москва

Д. А. Федоров

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: klimanova.ea@yandex.ru

Биологический факультет, кафедра биохимии

Россия, 119234, Москва

О. Е. Квитко

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: klimanova.ea@yandex.ru

Биологический факультет, кафедра биохимии

Россия, 119234, Москва

О. Д. Лопина

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: klimanova.ea@yandex.ru

Биологический факультет, кафедра биохимии

Россия, 119234, Москва

Е. А. Климанова

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: klimanova.ea@yandex.ru

Биологический факультет, кафедра биохимии

Россия, 119234, Москва

Список литературы

  1. Skou, J. C., and Esmann, M. (1992) The Na,K-ATPase, J. Bioenerg. Biomembr., 24, 249-261, https://doi.org/10.1007/BF00768846.
  2. Pollack, L. R., Tate, E. H., and Cook, J. S. (1981) Turnover and regulation of Na-K-ATPase in HeLa cells, Am. J. Physiol. Cell Physiol., 241, C173-C183, https://doi.org/10.1152/ajpcell.1981.241.5.C173.
  3. Koltsova, S. V., Trushina, Y., Haloui, M., Akimova, O. A., Tremblay, J., Hamet, P., et al. (2012) Ubiquitous [Na+]i/[K+]i-sensitive transcriptome in mammalian cells: evidence for Ca2+i-independent excitation-transcription coupling, PLoS One, 7, e38032, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038032.
  4. Haloui, M., Taurin, S., Akimova, O. A., Guo, D.-F., Tremblay, J., Dulin, N. O., et al. (2007) [Na+]i-induced c-Fos expression is not mediated by activation of the 5′-promoter containing known transcriptional elements, FEBS J., 274, 3557-3567, https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2007.05885.x.
  5. Taurin, S., Dulin, N. O., Pchejetski, D., Grygorczyk, R., Tremblay, J., Hamet, P., et al. (2002) c-Fos expression in ouabain-treated vascular smooth muscle cells from rat aorta: evidence for an intracellular-sodium-mediated, calcium-independent mechanism, J. Physiol., 543, 835-847, https://doi.org/10.1113/jphysiol.2002.023259.
  6. Shiyan, A. A., Sidorenko, S. V., Fedorov, D., Klimanova, E. A., Smolyaninova, L. V., Kapilevich, L. V., et al. (2019) Elevation of intracellular Na+ contributes to expression of early response genes triggered by endothelial cell shrinkage, Cell. Physiol. Biochem. Int. J. Exp. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol., 53, 638-647, https://doi.org/10.33594/000000162.
  7. Lopina, O. D., Fedorov, D. A., Sidorenko, S. V., Bukach, O. V., and Klimanova, E. A. (2022) Sodium ions as regulators of transcription in mammalian cells, Biochemistry (Moscow), 87, 789-799, https://doi.org/10.1134/S0006297922080107.
  8. Wolf, B. K., Zhao, Y., McCray, A., Hawk, W. H., Deary, L. T., Sugiarto, N. W., et al. (2023) Cooperation of chromatin remodeling SWI/SNF complex and pioneer factor AP-1 shapes 3D enhancer landscapes, Nat. Struct. Mol. Biol., 30, 10-21, https://doi.org/10.1038/s41594-022-00880-x.
  9. Nakagawa, Y., Rivera, V., and Larner, A. C. (1992) A role for the Na/K-ATPase in the control of human c-fos and c-jun transcription, J. Biol. Chem., 267, 8785-8788, https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)50347-7.
  10. Papp, C., Mukundan, V. T., Jenjaroenpun, P., Winnerdy, F. R., Ow, G. S., Phan, A. T., et al. (2023) Stable bulged G-quadruplexes in the human genome: identification, experimental validation and functionalization, Nucleic Acids Res., 51, 4148-4177, https://doi.org/10.1093/nar/gkad252.
  11. Sen, D., and Gilbert, W. (1990) A sodium-potassium switch in the formation of four-stranded G4-DNA, Nature, 344, 410-414, https://doi.org/10.1038/344410a0.
  12. Klimanova, E. A., Sidorenko, S. V., Abramicheva, P. A., Tverskoi, A. M., Orlov, S. N., and Lopina, O. D. (2020) Transcriptomic changes in endothelial cells triggered by Na,K-ATPase inhibition: a search for upstream Na+i/K+i sensitive genes, Int. J. Mol. Sci., 21, 7992, https://doi.org/10.3390/ijms21217992.
  13. Chashchina, G. V., Beniaminov, A. D., and Kaluzhny, D. N. (2019) Stable G-quadruplex structures of oncogene promoters induce potassium-dependent stops of thermostable DNA polymerase, Biochemistry (Moscow), 84, 562-569, https://doi.org/10.1134/S0006297919050109.
  14. Fedorov, D. A., Sidorenko, S. V., Yusipovich, A. I., Bukach, O. V., Gorbunov, A. M., Lopina, O. D., et al. (2022) Increased extracellular sodium concentration as a factor regulating gene expression in endothelium, Biochemistry (Moscow), 87, 489-499, https://doi.org/10.1134/S0006297922060013.
  15. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193, 265-275.
  16. Livak, K. J., and Schmittgen, T. D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method, Methods, 25, 402-408, https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.
  17. Ablasser, A., Bauernfeind, F., Hartmann, G., Latz, E., Fitzgerald, K. A., and Hornung, V. (2009) RIG-I-dependent sensing of poly(dA:dT) through the induction of an RNA polymerase III-transcribed RNA intermediate, Nat. Immunol., 10, 1065-1072, https://doi.org/10.1038/ni.1779.
  18. Koelsch, K. A., Wang, Y., Maier-Moore, J. S., Sawalha, A. H., and Wren, J. D. (2013) GFP affects human T cell activation and cytokine production following in vitro stimulation, PLoS One, 8, e50068, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050068.
  19. Collart, M. A., Tourkine, N., Belin, D., Vassalli, P., Jeanteur, P., and Blanchard, J. M. (1991) c-fos gene transcription in murine macrophages is modulated by a calcium-dependent block to elongation in intron 1, Mol. Cell. Biol., 11, 2826-2831, https://doi.org/10.1128/mcb.11.5.2826-2831.1991.
  20. Mechti, N., Piechaczyk, M., Blanchard, J. M., Jeanteur, P., and Lebleu, B. (1991) Sequence requirements for premature transcription arrest within the first intron of the mouse c-fos gene, Mol. Cell. Biol., 11, 2832-2841, https://doi.org/10.1128/mcb.11.5.2832-2841.1991.
  21. Coulon, V., Veyrune, J. L., Tourkine, N., Vié, A., Hipskind, R. A., and Blanchard, J. M. (1999) A novel calcium signaling pathway targets the c-fos intragenic transcriptional pausing site, J. Biol. Chem., 274, 30439-30446, https://doi.org/10.1074/jbc.274.43.30439.
  22. Yamada, T., Yamaguchi, Y., Inukai, N., Okamoto, S., Mura, T., and Handa, H. (2006) P-TEFb-mediated phosphorylation of hSpt5 C-terminal repeats is critical for processive transcription elongation, Mol. Cell, 21, 227-237, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2005.11.024.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Репортёрные векторы, использованные для изучения активности промоторной области гена FOS. а – Схематическое изображение векторов pFOS-TurboGFP и pRPLP0-TurboGFP, кодирующих TurboGFP-dest1 под управлением промотора FOS (от −549 до +155 п.о.) или промотора RPLP0 (от −700 до +295 п.о.). TSS – сайт старта транскрипции; ATG – старт-кодон. б – Электрофорез в 1,5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, ПЦР-продуктов промотора гена FOS (от −549 до +155 п.о.), полученных при использовании различных буферных растворов: 1 – коммерческий буферный раствор для Encyclo-полимеразы; 2 – коммерческий буферный раствор для GC-богатых последовательностей; 3 – модифицированный буферный раствор, в котором ионы K+ были замещены ионами Li+. Амплифицированная ДНК имела введённые сайты рестрикции для последующего клонирования, ожидаемая длина ПЦР-продукта составила 728 п.о.

Скачать (353KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Влияние различных экспериментальных воздействий на внутриклеточное содержание одновалентных катионов металлов в клетках HEK 293T. а – Трансфекция клеток HEK 293T векторами pFOS-TurboGFP и pRPLP0-TurboGFP увеличивала содержание Na+i на 60% и 40% соответственно и не оказывала существенного влияния на K+i. Трансфекционный реагент Lipofectamine 2000 сам по себе не влиял на Na+i и K+i. б – Инкубация клеток HEK 293T в присутствии 1 мкМ уабаина в течение 3 ч приводила к увеличению содержания Na+i примерно в 12 раз и оказывала противоположное действие на K+i. в – В клетках HEK 293T, инкубированных в Li-среде (содержащей 135 мМ Li+ и 5,5 мМ K+) в течение 5 ч, накапливалось 740 нмоль/мг белка Li+ и снижалось содержание Na+i и K+i относительно Na-среды (135 мМ Na+ и 5,5 мМ K+) – контрольной среды, имитирующей состав неорганических солей в среде DMEM. г – Фотографии клеток HEK 293T, инкубированных в присутствии 1 мкМ уабаина в течение 3 ч, в Na-среде или Li-среде в течение 5 ч. Данные представлены в виде экспериментальных значений (n = 6–8) и коробчатой диаграммы с границами усов, равными 1,5 межквартильного размаха. Статистически значимые отличия выявляли с помощью t-теста или ANOVA с последующим тестом Тьюки (* p < 0,05)

Скачать (854KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Экспрессия репортёрного белка TurboGFP-dest1 под управлением промотора FOS или RPLP0 в клетках HEK 293T. а – Конфокальные микрофотографии клеток HEK 293T, трансфицированных pFOS-TurboGFP или pRPLP0-TurboGFP. Спустя 48 ч после трансфекции клетки инкубировали в присутствии 1 мкМ уабаина в течение 3 ч, в Na-среде или в Li-среде в течение 5 ч. Масштабная линейка: 100 мкм. б – Распределения средней интенсивности флуоресценции TurboGFP-dest1 в отдельных клетках (n = 500–1000). Статистический анализ данных выявил небольшое, но достоверное увеличение флуоресценции репортёрного белка в ответ на воздействие уабаина в сравнении с контролем (DMEM). Аналогичный эффект наблюдали в клетках, инкубированных в Li-среде, в сравнении с Na-средой. Статистически значимые отличия выявляли с помощью U-теста Манна–Уитни (* p < 0,05)

Скачать (693KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Количество мРНК эндогенного FOS или TurboGFP-dest1 под управлением промотора FOS или RPLP0 в клетках HEK 293T. Клетки HEK 293T трансфицировали pFOS-TurboGFP или pRPLP0-TurboGFP. Спустя 48 ч после трансфекции клетки инкубировали в присутствии 1 мкМ уабаина в течение 3 ч, в Na-среде или в Li-среде в течение 5 ч. В клеточных лизатах измеряли уровень мРНК эндогенного FOS или TurboGFP-dest1 с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Данные представлены в виде среднего геометрического (GM) с границами усов от GM × SD (стандартное отклонение) до GM/SD с наложением экспериментальных значений (n = 4). Статистический анализ выявил значимое увеличение уровня мРНК эндогенного FOS в ответ на уабаин или Li-среду по сравнению с контролем или Na-средой соответственно. Статистически значимые отличия выявляли с помощью t-теста (* p < 0,05)

Скачать (350KB)
Метаданные
6. Приложение
Скачать (514KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025