Дизайн генно-инженерных конструкций, выделение и очистка мономерной формы рецептора GPR17 класса GPCR для структурно-функциональных исследований

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), – это семейство семиспиральных трансмембранных белков, состоящее более чем из 800 представителей в геноме человека, играющих ключевую роль в регуляции большинства процессов в организме и являющихся мишенями для трети всех современных лекарств. Многие GPCR, несмотря на значимость для фармакологии, до сих пор орфанные, т.е. эндогенный лиганд для них неизвестен. Орфанный рецептор GPR17, относящийся к классу А GPCR, экспрессируется преимущественно в центральной нервной системе, играет важную роль в регуляции образования миелиновой оболочки нейронов и представляет собой потенциальную мишень для разработки новых лекарственных препаратов против рассеянного склероза, болезни Альцгеймера и ишемии. Цель данной работы заключалась в подготовке GPR17 для структурно-функциональных исследований, начиная с модификации рецептора и заканчивая получением белкового препарата. Был проведен скрининг различных генно-инженерных конструкций, проанализирован ряд точечных мутаций, а также проверено значительное число потенциальных лигандов данного рецептора. В результате работы оптимизированы условия экспрессии, выделения и очистки GPR17, что в совокупности позволило получить достаточно стабильный и мономерный белковый препарат, подходящий для дальнейших структурных исследований.

Ключевые слова

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Н. А. Сафронова

Центр исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний, Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: mishinalexej@gmail.com
Россия, Долгопрудный

А. П. Лугинина

Центр исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний, Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: mishinalexej@gmail.com
Россия, Долгопрудный

А. А. Садова

Центр исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний, Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: mishinalexej@gmail.com
Россия, Долгопрудный

М. Б. Шевцов

Центр исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний, Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: mishinalexej@gmail.com
Россия, Долгопрудный

О. В. Моисеева

Центр исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний, Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: mishinalexej@gmail.com
Россия, Долгопрудный

В. И. Борщевский

Центр исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний, Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: mishinalexej@gmail.com
Россия, Долгопрудный

А. В. Мишин

Центр исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний, Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: mishinalexej@gmail.com
Россия, Долгопрудный

Список литературы

  1. Kuneš J., Hojná S., Mráziková L., Montezano A., Touyz R., Maletínská L. // Physiol Res. 2023. V. 72. P. S73–S90. https://doi.org/10.33549/physiolres.935109
  2. Marucci G., Dal Ben D., Lambertucci C., Martí Navia A., Spinaci A., Volpini R., Buccioni M. // Exp. Opin. Ther. Pat. 2019. V. 29. P. 85–95. https://doi.org/10.1080/13543776.2019.1568990
  3. Dziedzic A., Miller E., Saluk-Bijak J., Bijak M. // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. P. 1852. https://doi.org/10.3390/ijms21051852
  4. Ou Z., Sun Y., Lin L., You N., Liu X., Li H., Ma Y., Cao L., Han Y., Liu M., Deng Y., Yao L., Lu Q.R., Chen Y. // J. Neurosci. 2016. V. 36. P. 10560–10573. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0898-16.2016
  5. Yan S., Conley J.M., Reilly A.M., Stull N.D., Abhyankar S.D., Ericsson A.C., Kono T., Molosh A.I., Kubal C.A., Evans-Molina C., Ren H. // Cell Rep. 2022. V. 38. P. 110179. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.110179
  6. Ren H., Cook J. R., Kon N., Accili D. // Diabetes. 2015. V. 64. P. 3670–3679. https://doi.org/10.2337/db15-0390
  7. Sriram K., Insel P.A. // Mol. Pharmacol. 2018. V. 93. P. 251–258. https://doi.org/10.1124/mol.117.111062
  8. Khorn P.A., Luginina A.P., Pospelov V.A., Dashevsky D.E., Khnykin A.N., Moiseeva O.V., Safronova N.A., Belousov A.S., Mishin A.V., Borshchevsky V.I. // Biochemistry (Moscow). 2024. V. 89. P. 747–764. https://doi.org/10.1134/S0006297924040138
  9. Ye F., Wong T., Chen G., Zhang Z., Zhang B., Gan S., Gao W., Li J., Wu Z., Pan X., Du Y. // MedComm (Beijing). 2022. V. 3. P. e159. https://doi.org/10.1002/mco2.159
  10. Van Montfort R.L.M., Workman P. // Essays Biochem. 2017. V. 61. P. 431–437. https://doi.org/10.1042/EBC20170052
  11. Chun E., Thompson A.A., Liu W., Roth C.B., Griffith M.T., Katritch V., Kunken J., Xu F., Cherezov V., Hanson M.A., Stevens R.C. // Structure. 2012. V. 20. P. 967–976. https://doi.org/10.1016/j.str.2012.04.010
  12. Гусач А.Ю. // Структурные исследования человеческого цистеинил-лейкотриенового рецептора второго типа для создания новых лекарственных препаратов. Дис. канд. физ.-мат. наук, МФТИ, Москва, 2020.
  13. Ballesteros J.A., Weinstein H. // Methods Neurosci. 1995. V. 25. P. 366–428. https://doi.org/10.1016/S1043-9471(05)80049-7
  14. Bläsius R., Weber R.G., Lichter P., Ogilvie A. // J. Neurochem. 1998. V. 70. P. 1357–1365. https://doi.org/10.1046/j.1471-4159.1998.70041357.x
  15. Cherezov V., Abola E., Stevens R.C. // Methods Mol. Biol. 2010. P. 141–168. https://doi.org/10.1007/978-1-60761-762-4_8
  16. Popov P., Peng Y., Shen L., Stevens R.C., Cherezov V., Liu Z.J., Katritch V. // Elife. 2018. V. 7. P. e34729. https://doi.org/10.7554/eLife.34729
  17. Alexandrov A.I., Mileni M., Chien E.Y.T., Hanson M.A., Stevens R.C. // Structure. 2008. V. 16. P. 351–359. https://doi.org/10.1016/j.str.2008.02.004
  18. Luginina A., Gusach A., Marin E., Mishin A., Brouillette R., Popov P., Shiriaeva A., Besserer-Offroy É., Longpré J.M., Lyapina E., Ishchenko A., Patel N., Polovinkin V., Safronova N., Bogorodskiy A., Edelweiss E., Hu H., Weierstall U., Liu W., Batyuk A., Gordeliy V., Han G. W., Sarret P., Katritch V., Borshchevskiy V., Cherezov V. // Sci. Adv. 2019. V. 5. P. eaax2518. https://doi.org/10.1126/sciadv.aax2518
  19. Ciana P., Fumagalli M., Trincavelli M.L., Verderio C., Rosa P., Lecca D., Ferrario S., Parravicini C., Capra V., Gelosa P., Guerrini U., Belcredito S., Cimino M., Sironi L., Tremoli E., Rovati G.E., Martini C., Abbracchio M.P. // EMBO J. 2006. V. 25. P. 4615–4627. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601341
  20. Maekawa A., Balestrieri B., Austen K.F., Kanaoka Y. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 11685– 11690. https://doi.org/10.1073/pnas.0905364106
  21. Benned-Jensen T., Rosenkilde M.M. // Br. J. Pharmacol. 2010. V. 159. P. 1092–1105. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2009.00633.x
  22. Qi A.D., Harden T.K., Nicholas R.A. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2013. V. 347. P. 38–46. https://doi.org/10.1124/jpet.113.207647
  23. Hennen S., Wang H., Peters L., Merten N., Simon K., Spinrath A., Blättermann S., Akkari R., Schrage R., Schröder R., Schulz D., Vermeiren C., Zimmermann K., Kehraus S., Drewke C., Pfeifer A., König G.M., Mohr K., Gillard M., Müller C.E., Lu Q.R., Gomeza J., Kostenis E. // Sci. Signal. 2013. V. 6. P. ra93. https://doi.org/10.1126/scisignal.2004350
  24. Merten N., Fischer J., Simon K., Zhang L., Schröder R., Peters L., Letombe A., Hennen S., Schrage R., Bödefeld T., Vermeiren C., Gillard M., Mohr K., Lu Q.R., Brüstle O., Gomeza J., Kostenis E. // Cell Chem. Biol. 2018. V. 25. P. 775–786.e5. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2018.03.012
  25. Simon K., Merten N., Schröder R., Hennen S., Preis P., Schmitt N., Peters L., Schrage R., Vermeiren C., Gillard M., Mohr K., Gomeza J., Kostenis E. // Mol. Pharmacol. 2017. V. 91. P. 518–532. https://doi.org/10.1124/mol.116.107904
  26. Harrington A.W., Liu C., Phillips N., Nepomuceno D., Kuei C., Chang J., Chen W., Sutton S.W., O’Malley D., Pham L., Yao X., Sun S., Bonaventure P. // Br. J. Pharmacol. 2023. V. 180. P. 401–421. https://doi.org/10.1111/bph.15969

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Дополнительные материалы
Скачать (636KB)
Метаданные
3. Рис. 1. Результаты гель-фильтрации для конструкции R252-BRIL-V253 с различными точечными мутациями и их комбинациями. SE – поверхностная экспрессия (surface expression).

Скачать (145KB)
Метаданные
4. Рис. 2. Диаграмма, отражающая термический сдвиг в результате внесения в GPR17 точечных мутаций. Показаны усредненные значения, полученные в результате трех независимых экспериментов.

Скачать (84KB)
Метаданные
5. Рис. 3. Схематичное изображение лучшей конструкции. Красным цветом обозначены внесенные точечные мутации, фиолетовым – партнерный белок BRIL, розовым – HA-фрагмент, желтым – последовательность FLAG, голубым – 9 остатков гистидина, оранжевым – сайт протеазы TEV, серым – атавистические линкеры.

Скачать (496KB)
Метаданные
6. Рис. 4. Нормализованная кривая плавления (а) и результаты аналитической гель-фильтрационной ВЭЖХ (б) для самой лучшей конструкции R252-BRIL-V253 с мутациями A1313.24L + Y1483.41W + F1583.51Y + F2315.49L + I2345.52L + A3297.57D. Сплошная линия – образец с концентрацией 0.1 мг/мл, пунктирная – 30 мг/мл.

Скачать (114KB)
Метаданные
7. Рис. 5. Влияние солевого состава буфера на термостабильность GPR17. Показаны кривые плавления для нескольких конструкций рецептора. Для каждой конструкции эксперимент проводился в трех разных буферах: синие линии соответствуют буферу с NaCl в составе, зеленые – с KCl, а оранжевые – с MgCl2. Концентрации солей в данном эксперименте составляла 500 мМ.

Скачать (158KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025